HPLC法测定联苯乙酸凝胶含量和有关物质

汪平，张军兵，武惠斌，聂红梅（1.河南羚锐制药股份有限公司，河南新县465550；2.北京羚锐伟业科技有限公司，北京 100070）

HPLC法测定联苯乙酸凝胶含量和有关物质

汪平1，2＊，张军兵1，2，武惠斌1，2，聂红梅1，2（1.河南羚锐制药股份有限公司，河南新县465550；2.北京羚锐伟业科技有限公司，北京 100070）

目的：建立测定联苯乙酸凝胶的含量和有关物质的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Kromasil C18，流动相为甲醇-0.1%冰醋酸（65∶35），流速为1.0mL·min－1，检测波长为254nm。结果：联苯乙酸检测浓度线性范围为0.3～60μg·mL－1（r＝0.9998），低、中、高浓度平均回收率分别为100.3%、101.2%、99.8%，RSD＝0.24%（n＝9）；3批样品主药和有关物质含量均符合限度要求。结论：本方法简便快速、重复性好，可用于控制联苯乙酸凝胶的质量。

联苯乙酸凝胶；有关物质；含量；高效液相色谱法

联苯乙酸为非甾体抗炎药，由日本Lederle公司研制，其凝胶剂1986年首先在日本上市，局部用于消炎镇痛，主要用于变形性关节炎、肩周炎、腱鞘炎、腱周炎、肌肉痛、外伤后肿胀疼痛、软组织损伤等的镇痛消炎[1]。为控制该制剂质量、保证临床疗效，笔者对其含量和有关物质测定方法进行了研究。

1 仪器与试药

LC-20A型高效液相色谱（HPLC）仪，包括SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱温箱、SPD-20A紫外-可见检测器、LC Solution色谱工作站（日本岛津公司）；CP225D型电子天平（德国Sartorius公司）。

样品：联苯乙酸凝胶（北京羚锐伟业科技有限公司，批号：000703、000704、000705，规格：10g∶0.3g）；联苯乙酸原料药（天津药物研究院，批号：000512，纯度：99.98%）；联苯乙酸对照品（英国LGC公司，批号：Y0000731，纯度：100%）；联苯对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110843-9501，纯度：100%）；邻苯基苯甲酸对照品（批号：A0270674，纯度：99.8%）、4-乙酰联苯对照品（批号：MKBG0866V，纯度：99.9%）均系美国SigmaAldrich公司产品；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 有关物质

邻苯基苯甲酸为联苯乙酸合成过程中产生的副产物，联苯为联苯乙酸的起始原料，4-乙酰联苯为联苯乙酸的降解产物。但因为邻苯基苯甲酸在联苯乙酸原料药的质量研究中并未检出，故在联苯乙酸凝胶中不作为已知杂质考察，但将其与联苯乙酸的分离度用以考察系统适用性。

2.1.1 色谱条件[2]。色谱柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸（65∶35），流速：1.0mL·min－1；检测波长：254nm。理论板数按联苯乙酸峰计不低于5000。

2.1.2 测定法。供试液：取样品适量（相当于联苯乙酸3mg），精密称定，加流动相溶解并定量稀释至10mL量瓶中，摇匀，过滤，即得。对照液（1）：取供试液3倍体积，加流动相稀释到100倍体积，再取此溶液1倍体积加流动相稀释到10倍体积，摇匀，即得。对照液（2）：取4-乙酰基联苯与联苯对照品适量，精密称定，以少量甲醇溶解后，加流动相定量稀释成每1mL中含4-乙酰联苯0.3μg、联苯0.3μg的混合溶液，即得。

取对照液（1）20μL进样，调节检测灵敏度，使主成分峰高约为满量程的15%，再取供试液和对照液（1）、（2）各20μL，分别进样，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。供试液的色谱图中如出现与对照液（2）中2个主峰相对应的峰，其任何一个峰面积均不得大于相对应的主峰面积（每个0.1%）；其他单个杂质峰面积均不得大于对照液（1）主峰面积的1/3（0.1%）；未知杂质总和不得过1.0%。空白基质、对照液（1）、对照液（2）、供试液色谱详见图1。

2.1.3 线性关系考察。取样品适量，照供试液的制备方法制成每1mL中约0.5mg的溶液，分别精密量取该溶液适量，加流动相制成每1mL中约含联苯乙酸2、4、6、8、10µg的溶液，分别进样。以浓度（c）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，拟合曲线，得方程A＝5502.3c+45.1（r＝0.9996）。结果表明，联苯乙酸检测浓度线性范围为2～10μg·mL－1。

2.1.4 重复性试验。取样品（批号：000703）6份，制备成供试液后测定，结果RSD＝0.22%，表明本方法重复性良好。

2.1.5 强制降解试验。取联苯乙酸凝胶适量照供试液制备方法制备成1.5mg·mL－1的溶液作为贮备液。分别取贮备液适量用1mol·L－1的盐酸、1mol·L－1的氢氧化钠、80℃高温、30%双氧水、4000lx光照破坏放置3h后定容至浓度为0.3mg·mL－1的溶液，滤过，作为供试品溶液测定，并同法制备空白溶液测定。结果本品比较稳定，碱、高温条件下略有降解，约降解0.5%和0.8%，其他条件下几乎未降解，详见图2。

图1 有关物质检查中相关高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of related substances

图2 有关物质降解试验高效液相色谱图1.碱破坏后样品；2.样品；3.酸破坏后样品；4.高温破坏后样品；5.空白；6.氧化破坏后样品；7.光照破坏后样品Fig 2HPLC chromatograms of degradation experiment of related substances1.sample destroyed by alkaline；2.sample；3.sample destroyed by acid；4.sample destroyed by high temperature；5.blank control；6.sample destroyed by oxidation；7.sample destroyed by light

2.1.6 稳定性试验。取供试液1份，分别放置0、2、4、6、8h测定，结果RSD＝0.83%，表明供试液放置8h内稳定。

2.1.7 有关物质测定结果。3批样品中杂质含量均符合限度要求，详见表1。

表1 3批样品中有关物质测定结果Tab 1 Result of related substances test of 3batches of samples

2.2 主药含量测定

2.2.1 色谱条件与线性关系考察。色谱条件同“2.1.1”项，线性关系考察方法操作同“2.1.3”项，分别制备浓度为0.3、3、6、9、12、24、30、36、47.5、60μg·mL－1的联苯乙酸对照品溶液进样分析，得回归方程A＝151604c－25888（r＝0.9998），联苯乙酸检测浓度线性范围为0.3～60μg·mL－1。

2.2.2 分离度测定。精密称取联苯乙酸和邻苯基苯甲酸对照品适量，用流动相制备成各含4μg·mL－1混合溶液，进样分析，记录色谱峰，计算2个主峰之间的分离度。结果，联苯乙酸和邻苯基苯甲酸保留时间分别为10.175、13.628min，分离度为7.93，详见图3。

图3 分离度试验高效液相色谱图Fig 3 HPLC chromatograms of separation degree test

2.2.3 精密度试验。分别取浓度为3、6μg·mL－1的联苯乙酸对照品溶液，重复进样6次，结果RSD分别为0.65%和0.71%，表明本法精密度良好。

2.2.4 回收率试验。精密称取本品空白基质0.134g 9份，各置于50mL量瓶中，分别加入浓度为1mg·mL－1的联苯乙酸对照品溶液3（80%）、4（100%）、5（120%）mL各3份，加流动相定容至刻度摇匀；再精密量取此液1mL置于20mL量瓶中，加流动相稀释至刻度摇匀，滤过，进样测定。得低、中、高浓度平均回收率分别为100.3%、101.2%、99.8%，RSD＝0.24%（n＝9）。

2.2.5 重复性试验。取同一批样品（批号：000703）按“2.2.6”项下方法制备成供试品溶液，测定6次，结果RSD＝0.45%，表明本方法的重复性好。

2.2.6 含量测定。精密称取样品适量（约相当于联苯乙酸4mg），加流动相溶解并定量稀释至100mL量瓶中，摇匀；精密量取5mL，置于50mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液；取联苯乙酸对照品适量，加流动相溶解制备成4μg·mL－1溶液，作为对照品溶液；另取样品和邻苯基苯甲酸对照品适量，加流动相制备成浓度均为4μg·mL－1的混合溶液，作为分离度测定溶液。取分离度测定溶液适量进样，记录色谱峰，计算2个主峰之间的分离度，分离度不得小于3，否则试验无效。精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μL进样，记录色谱峰，按外标法以峰面积计算含量，结果3批样品平均含量分别为100.30%、98.32%、100.40%。

3 论

联苯乙酸对照品溶液在254nm波长处有最大吸收，且空白基质在此处无干扰，故选254nm为其含量测定波长。

因本品结构简单，故选择通用的反相高效液相色谱法检测有关物质和含量。流动相中的冰醋酸主要起缓冲和改善分离的作用，既可提高方法的重复性，又可以改善峰形和分离情况，亦可防止联苯乙酸在分离过程中的解离和降解。

笔者曾经尝试过多种品牌的、不同长度的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱进行试验，结果分析效果均比较好。但是系统适用性试验仍然是非常必要的，如果邻苯基苯甲酸与联苯乙酸的分离度不足3，则很有可能导致有关物质测定时未知杂质之间的分离度小于1.5。

经过详细的方法学验证，结果表明，本方法简便快速、重复性好，可用于控制联苯乙酸凝胶的质量。

[1] 佚 名.联苯乙酸凝胶剂、搽剂（3.1类）[J].中国医药技术与市场，2006，6（2）：46.

[2] 刘亚楠，王 伟.高效液相色谱法测定联苯乙酸原料及其制剂的有关物质[J].华夏医学，2010，23（4）：375.

Content Determination of Felbinac Gel and Related Substances by HPLC

WANG Ping，ZHANG Jun-bing，WU Hui-bin，NIE Hong-mei（Henan Lingrui Pharmaceutical Co.，Ltd.，Henan Xinxian 465550，China）
WANG Ping，ZHANG Jun-bing，WU Hui-bin，NIE Hong-mei（Beijing Lingrui Weiye Technology Co.，Ltd.，Beijing 100070，China）

OBJECTIVE：To determine the contents of Felbinac gel and related substance.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18with mobile phase consisted of methanol-0.1%glacial acetic acid（65∶35）at the flow rate of 1.0mL·min－1.The detection wavelength was set at 254nm.RESULTS：The linear range of felbinac was 0.3～60μg·mL－1（r＝0.9998），and average recoveries were 100.3%，101.2%，99.8%at low，medium and high concentrations（RSD＝0.24%，n＝9）.The contents of main component and impurity in 3batches of samples were in line with the requirements of limit.CONCLUSION：The method is simple，rapid and reproducible，and it can be used for the quality control of Felbinac gel.

Felbinac gel；Related substances；Content；HPLC

R927.2；R971+.1

A

1001-0408（2012）33-3142-02

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.33.28

＊主管药师。研究方向：药理学。电话：010-82614159。E-mail：funnyping@sina.com

2012-01-18

2012-05-20）