Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞与新生儿溶血病发病率的相关性研究

周 英，李 健，吕文彬，陈 雪，王乃红，迭 敏

（成都市血液中心，四川 成都610041）

Rh血型在临床输血中具有重要意义，也是人类红细胞血型系统中最为复杂、最具多态性的系统，其中RhD抗原因其能引起溶血性输血反应及新生儿溶血病而倍受重视［1］。新生儿溶血病（HDN）是由于母婴血型不合，母体血中存在与胎儿血型抗原相应的免疫性抗体（IgG型），此种特异性抗体可通过胎盘进人胎儿，引起胎儿红细胞破坏而发生溶血，并伴随一系列病理损害，如黄疽，贫血，肝脾肿大等症状［2］。在我国，ABO血型不合导致新生儿溶血较多见，病情较轻；Rh（D）血型不合导致新生儿溶血较少见，但病情较重，具有黄疸出现早，发展迅速，病情危重等特点，易致死与致残，它的治疗的关键在于早发现，早预防，早治疗［3］。因此，较早对 Rh（D）阴性孕妇进行胎儿是否发生Rh（D）血型不合导致新生儿溶血的评估显得尤为重要。目前预防、诊断Rh（D）血型不合导致新生儿溶血病的基础是检测胎－母出血量［4］，采用血清学方法定性检测母体是否被胎儿红细胞致敏。随着科学技术的发展，流式细胞术能对血液中微量细胞群进行定性及定量的分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点；有资料显示，通过流式细胞仪计数胎儿红细胞的数量，此方法灵敏度可达0.001%，是目前检测胎儿红细胞的最佳方法［5］。本研究采用相关文献［1］中建立的流式细胞术检测Rh（D）血型不合导致新生儿溶血病，探讨其在产前诊断中的价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

经Rh（D）抗原初筛实验为阴性的医院送检孕妇标本30例，妊娠周期为20～38周，年龄为18～35周岁，其中27例在孕期大于32周后追踪检测2次。

1.2 试剂与仪器

抗－D（IgG）单克隆抗体（上海血液生物医药有限责任公司，效价1：32，批号20070119），RhD（IgM＋IgG）单克隆抗体（Biotest，德国，批号1110906），抗－D（IgM＋IgG）单克隆抗体（Dominion公司，加拿大，批号 NDMG04203），抗－D（IgM＋IgG）单克隆抗体（Celliance公司，英国，批号BMJ0506G），广谱抗人球蛋白试剂（上海血液生物医药有限责任公司，批号20061221），FITC－抗人IgG（γ），F（ab’）2纯化抗体（KPL公司，美国，批号2021002），EPICS XL流式细胞仪（COULTER，美国），CX41显微镜（OLYMPUS），三用电热恒温水温箱（上海跃进医疗器械厂）。

1.3 方法

1.3.1 Rh表型血清学鉴定 RhD初筛及阳性判定按照《中国输血技术操作规程》操作，RhD初筛阴性者的红细胞分别与4种不同厂家和批号的单克隆抗－D做间接抗人球蛋白试验（IAT），设阴性及阳性对照。与4批抗－D反应全部无凝集者判定为RhD阴性。

1.3.2 流式细胞术检测用红细胞的制备 取待检孕妇红细胞500μl，磷酸盐缓冲液（PBS，PH7.4）洗涤3遍，配成细胞悬液，显微镜计数红细胞的浓度，调细胞浓度为1×106／μl。同时设RhD阳性对照和阴性对照管。

1.3.3 流式细胞术分析 待检孕妇红细胞悬液（细胞浓度为1×106／μl）50μl，加人源单克隆IgG 抗－D（批号20070119）50μl混匀，37℃孵育30min，PBS洗涤3遍，加 FITC－抗人IgG（γ），F（ab’）2纯化抗体15μl（浓度为3μg／15μl），室温避光反应30min，PBS洗涤3遍，细胞以500uLPBS重悬，上机检测。根据前向角散射（FSC）与侧向角散射（SSC），设定“门”，使红细胞与血小板、细胞碎片区别开来。收集50000个细胞，记录光散射及荧光数据。每次测定前以Flowcheck调整仪器的光路和流路。

1.3.4 确定阴性阈值 取5份RhD阴性标本（经查证为未孕女性）作为阴性对照细胞，处理方法如上所示。对其红细胞悬液进行流式细胞术检测，以阳性反应细胞百分数均值（±2s）设定阴性阈值。

1.3.5 患儿标本血清学检测HDN 在30例阴性孕妇产后，取患儿血液标本，采用血清学方法进行红细胞直接抗人球蛋白试验、抗体筛选或抗体鉴定试验。根据试验结果判定患儿是否为HDN（患儿Rh血型均为阳性）。

1.4 统计学处理

采用SPSS12.0进行统计分析。

2 结果

2.1 血型血清学结果

经Rh（D）抗原确认试验，阴性孕妇标本为30例。

2.2 Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞流式细胞术检测与患儿标本血清学检测结果比较，见表1。

表1 Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞流式细胞术检测与患儿标本血清学检测结果比较

2.3 追踪检测两次27例Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞比例，见表2。

表2 追踪检测两次27例Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞流式细胞术检测值比较

3 讨论

Rh血型系统是人类血型中最具多态性和免疫遗传特性的一个系统，迄今已发现含有49个独立的抗原，是输血医学中除ABO血型之外最具临床意义的一个血型系统。RhD抗原的高免疫原性常常会引起胎儿和新生儿溶血病（HDN）、溶血性输血反应和自身免疫性溶血性贫血等疾病［6，7］。HDN是临床常见的因母婴血型不合导致新生儿溶血病，可以引起高胆红素血症、贫血等。虽然Rh（D）血型不合导致新生儿溶血病发生的机率较少，但其后果严重，孕期易导致流产、死胎，新生儿极易发生黄疸、水肿、贫血、肝脾肿大及胆红素脑病，甚至死亡。在产前对Rh（D）阴性孕妇进行有效地评估显得尤为重要。

本次研究采用流式细胞术检测30例Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞；在孕妇产后取患儿血液标本，采用血清学方法进行新生儿溶血病的检测。两组数据由表1可以看出，Rh（D）血型不合，流式细胞术检测与血清学检测结果比较差异不显著。有文献报道［8］，Rh血型不合 HDN，由于RH抗原位点多且抗原决定簇在细胞外暴露多，比较容易被检出，因此流式法和试管法的检测阳性率均为100%。此次研究结果与报道基本相符。

胎儿细胞在母体内具有一定的消长规律。利用检测母亲外周血胎儿红细胞进行非创伤性产前诊断的最佳时间一直存在争议。但目前普遍认为，理想时间为早期和中期妊娠［9］。Sonda等［10］利用 CD71和GPA双抗体经FACS技术证实NRBC的浓度在孕7～l8周最高。我们对孕妇体内胎儿微量Rh（D）红细胞所占比例进行了追踪检测，由表2可以看出追踪检测两次的数据比较差异不显著。本次研究由于条件限制，仅对孕妇进行了2次追踪检测，在今后的研究中还可以进行更详细的追踪检测，有待进一步探讨。

本次研究的数据显示，运用流式细胞术检测妊娠24周左右的Rh（D）阴性孕妇血液中胎儿微量Rh（D）红细胞的方法，能较早预测新生儿溶血病发生的可能性，在一定程度上有助于新生儿溶血病的早期预防、治疗、诊断，为抗D引起新生儿溶血病患儿的换血治疗赢得了宝贵时间，减少了出现严重后遗症的可能性。本研究具有灵敏度较高、实验结果易于判定、实验的准确度和重复性较好等优点，在临床上有较大的运用价值。建议Rh（D）阴性孕妇在24周左右常规做流式细胞术检测，为Rh（D）血型不合导致新生儿溶血病提供了一种早期预防﹑诊断的可靠依据，具有一定的社会效益和经济效益。

［1］周 英，陈 雪，李健等.流式细胞术检测RhD（－）血液中微量D（＋）红细胞的研究［J］.中国输血杂志，2008，21（5）：346－348.

［2］万艳红.“O”型孕妇产前免疫学检测对判断新生儿溶血病价值的探讨［J］.中国实用医药，2007，2（2）：47.

［3］杨江存，韩梅宁，张献清.Rh血交换治疗32例新生儿溶血病分析［J］.第四军医大学学报，2005，26（24）：2280.

［4］Moise KJ.Red blood cell alloimmunization in pregnancy［J］.Semin Hematol.2005，42（3）：169.

［5］王建中，临床流式细胞分析［M］.上海：上海科学技术出版社，2005.372.

［6］Avent ND，Reid ME.The Rh blood group system：a review［J］.Blood，2000，95（2）：375.

［7］Urbaniak SJ.Alloimmunity to RhD in humans［J］.Transfus clin Biol.2006，13（1－2）：19.

［8］戎 霞，罗广平，付涌水，等.流式细胞术在母婴血型不合新生儿溶血病检测中的应用［J］.热带医学杂志，2008，8（8）：791－793.

［9］陈汉平，沈 怡，张汉凤等.运用流式细胞技术分析孕妇外周血中胎儿有核红细胞的比例与孕周的关系［J］.实用妇产科杂志，2002，3（18）：104.

［10］Sonda Sa1cshi.Arinam T Hanada H，et al.The proportion of fetal Nucleared red blood cells in maternal blood：estimation by FACS Analysis Prenat Diagn［J］.Blood，1997，17：743.