Desmin在大肠癌与癌旁组织中的表达及意义

张 晶，李卫凯，谢志威，刘健婷，梁齐合，何成彦，赵海丰

（1.江门市中心医院 检验科，广东 江门529070；2.吉林大学中日联谊医院；3.佳木斯大学第一附属医院，黑龙江 佳木斯154003）

大肠癌是当前严重危害人类健康的恶性肿瘤。全世界每年大约有100万大肠癌新发例，49.2万人死于大肠癌［1］。近年来，大肠癌的诊断及综合治疗水平取得了很大的进展，但其发病率和死亡率并未发生根本性的变化，因此大肠癌复杂的发病机制需要继续不断的研究。Desmin是一种重要的细胞骨架蛋白，在维持细胞内结构和胞外基质联结中起重要的作用。近年来细胞骨架蛋白在恶性肿瘤的发生和侵袭中起的作用逐渐受到重视，骨架蛋白在各种恶性肿瘤中的研究也成为热点，但是关于Desmin在恶性肿瘤中的研究较少，为此本文应用蛋白质组学中的先进技术－液质联用技术研究了Desmin在大肠癌及癌旁组织中的表达及临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集佳木斯大学第一附属医院18例手术治疗的大肠癌患者的肿瘤组织标本均经病理学检查证实及各患者距离肿瘤组织边缘10cm以外的上端癌旁组织标本，术前均经患者同意。患者术前均未接受任何治疗，年龄49－78岁，中位年龄57岁，其中男13人，女5人。将所获得的新鲜标本离体后用生理盐水冲洗干净后，放入液氮冷冻，－80℃保存。

1.2 主要试剂

Bio－Rad公司的碘代乙酰胺（IAA）、尿素（Urea）、硫脲（Thiourea）、三羟甲基氨基甲烷（Tris base）、3－［（3－胆酰胺丙基）－二 乙胺］－丙磺酸（CHAPS）、碳酸氢氨、苯甲基磺酰氟（PMSF）、Sigma公司的DNA酶和RNA酶、超纯水、安捷伦公司的1200纳升级液相色谱分析仪和赛默飞世尔公司的LTQXL离子肼质谱仪。

1.3 实验方法

（1）组织总蛋白质的提取及蛋白浓度分析：对组织标本进行研磨，裂解，低温匀浆，离心，将蛋白上清液吸出备用，使用核酸蛋白分析仪检测后利用标准曲线分析计算蛋白浓度。

（2）组织蛋白水解多肽混合物的制备：提取的组织蛋白用25mM NH4HCO3稀释，使尿素浓度低于2M，加入1M的DTT，充分混匀，使其终浓度为20 mM，56℃下还原1h后降至室温加入1M的碘乙酰胺混匀使其终浓度为50mM，常温下避光反应30分钟，按1∶50加入测序级胰酶37℃酶切过夜。

（3）二维色谱与质谱联用分析与数据库检索：将所有样品用缓冲液A溶解，各取50μg样本上样经反相色谱洗脱的多肽应用LTQ XL质谱仪检测，核质比检测范围为400－2000amu，应用数据依赖方式进行次二级质谱扫描。

（4）应用实验中每个蛋白的谱图数来评价其丰度。对于在不同样品中丰发生变化的蛋白，其谱图数变化必须满足以下原则：1、两个样品中谱图数的比值大于等于1；2、两个样品中谱图数的差值大于等于72（平均每次实验差值为24）。每个样品进行三次实验，然后将结果相互比较分析，将肿瘤与癌旁组织的蛋白质组分析的结果进行比对，将得到的有显著差异的蛋白，挑选出Desmin进行免疫印迹实验验证准确性。

1.4 统计学分析

液质联用图谱依据SEQUEST算法，使用SPSS13.0统计软件包进行t检验。P＜0.05为有显著性差异。

2 实验结果

2.1 通过液质联用技术鉴定出在肿瘤组织中与癌旁组织中表达有显著差异蛋白，结果见表1。

表1 二维色谱与质谱鉴定的有显著差异的肿瘤组织下调蛋白

2.2 本文着重探讨Desmin蛋白，Desmin蛋白免疫印迹结果见下图。

图中AB分别代表癌旁组织及癌组织，表明Talin在肿瘤组织中较癌旁组织中表达降低，具有显著性差异。

3 讨论

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其生长、转移、复发是一个连续过程，因此，阐明大肠癌的发生、发展和转移机制及其影响因素是目前肿瘤研究的重大课题。以往很多研究证明大肠癌的生长是个复杂的多基因参与的多步骤过程，明确其相关基因及蛋白质的作用，研究其发生和发展的机制，筛选和鉴定大肠癌生物学标志物，从而在肿瘤治疗取得突破，也就成为肿瘤研究的最前沿领域和热点。肿瘤蛋白质组技术为实现上述研究提供了可靠的新技术。

正常细胞中细胞骨架稳定，细胞运动很少，癌变的细胞细胞骨架破坏，细胞运动增加［3］，这是癌细胞突出特点，向外围组织侵袭，细胞迁移运动调节机制在此过程中起重要作用。结蛋白是476个氨基酸构成的一种高度保守的肌肉组织中间丝蛋白，包括一个起调节蛋白结合的氨基端，一个含有二聚化结合位点的羧基端，和一个α螺旋的杆状体区，其中杆状体区又分成1A、1B、2A和2B四个结构域［2］。结蛋白通过网格蛋白连接于肌原纤维的Z线，使邻近的肌原纤维彼此连接，起到动力传导作用。同时把肌原纤维与细胞核、肌膜下细胞骨架和胞浆内的细胞器连接，起到细胞内信号传导作用。目前，Desmin在肌病、肌源性肿瘤研究较多，而在恶性肿瘤方面研究不是很多，朱雪琼等［3］研究发现Desmin在子宫内膜间质肉瘤较富于细胞平滑肌瘤之间差异有高度显著性，在子宫内膜间质肉瘤中表达较富于细胞平滑肌瘤降低；张汝玲等［4］研究发现在胰腺癌组织中Desmin表达呈强阳性；Cheng Wu等［5］通过双向凝胶电泳与质谱技术发现，Desmin在胃癌较癌旁组织中表达增加；Ma，LY［6］通过双向凝胶电泳和质谱技术在筛选大肠癌肿瘤标志物时发现Desmin在大肠癌中表达增加。本研究采用蛋白质组学技术中的液质联用技术检测了Desmin蛋白在大肠癌组织与癌旁组织中的表达情况。研究发现Desmin蛋白在大肠癌组织中的表达显著低于癌旁组织，提示Desmin低表达与大肠癌癌变有关。尽管有关Desmin的研究结果存在分歧，但都说明了Desmin在肿瘤发生中起一定的作用，具体机制目前还不清楚，因此，Desmin蛋白在恶性肿瘤的发生机制仍需要进一步深入的研究。

［1］Weitz J，Koch M，Debus J，et al.Colorectal cancer［J］.Lancet，2005，365（9454）：153.

［2］Sharma S，Mücke N，KatusHA，et al.Disease mutations in the“head”domain of the extra－sarcomeric protein desmin distinctly alter its assembly and network－forming properties［J］.J Mol Med，2009，87（12）：1207.

［3］朱雪琼，石一夏，赵承洛.子宫内膜间质肉瘤特异性标志物的研究［J］.现代妇产科进展，2003，12（5）：354.

［4］张汝玲，王兴鹏，吴 恺，等.胰腺星状细胞在胰腺癌组织中的激活及其可能作用［J］.胰腺病学，2002，2（1）：45.

［5］WU C，LUO ZW，CHEN XY，et al.Two－dimensional differential in－gel electrophoresis for identification of gastric cancer－specific protein markers［J］.Oncology Reports，2009，21：1429.

［6］Ma LY，Peng JY，Liu WJ，et al.Proteomics Identification of Desmin as a Potential Oncofetal Diagnostic and Prognostic Biomarker in Colorectal Cancer［J］.Molecular and Cellular Proteomics？，2009，8：1878.