雷公藤甲素通过调节microRNA21的表达干预K562/A02细胞的化疗敏感性

惠璐璐，许文林，沈慧玲，陈巧云，朱小兰，龙璐璐，徐颖

(江苏大学附属人民医院中心实验室，江苏镇江212002)

MicroRNAs是1993年Lee等［1］在线虫发育的研究中首先发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长约21～24个核苷酸。它通过干扰mRNA的翻译而下调靶基因的表达，能够对基因表达进行微调，参与生命过程中一系列的重要进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡等［2］。近年来，越来越多的研究表明，microRNAs能够影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性［3］。有研究证明，抑制microRNA21表达能增强白血病细胞对化疗药物的敏感性［4］。

前期研究发现［5］，雷公藤甲素(triptolide，TPL)是从中药雷公藤中提取的环氧化二萜内酯化合物，对K562/A02细胞中microRNA21表达有下调作用。本实验旨在探讨TPL提高K562/A02化疗敏感性相关机制，为临床白血病多药耐药的逆转提供一条新的思路。

1 材料和方法

1.1 材料

人慢性髓系白血病细胞株K562及其耐药株K562/A02购于中科院上海细胞库。K562细胞、K562/A02细胞置于含10%小牛血清的RPMI1640培养液，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中常规培养，2～3 d换液1次，K562/A02细胞培养液中含多柔比星(doxorubicin，DOX)终浓度为 1.0 μg/ml以维持其耐药性，实验前脱药培养2周，取对数生长期的细胞进行实验。多柔比星为浙江海正制药厂产品。噻唑蓝(MTT)为Sigma公司。雷公藤甲素购自美国Sigma公司，RPMI1640培养基、胎牛血清均购自美国GibcoBRL公司。AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自美国Biovision公司。PI试剂盒购自Sigma公司，4℃保存。SYBR Green荧光定量PCR试剂盒购自大连宝生物公司。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测TPL的细胞毒性 取对数生长期的细胞调整细胞浓度为2×105/ml，接种于96孔培养板，每孔加入细胞悬液200 μl，24 h后，设置调零孔，空白对照孔和加药孔，每孔设3个复孔，置37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养72 h，每孔加MTT 20 μl，继续培养4 h，弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150 μl，终止反应。在酶联免疫测定仪上检测波长570 nm处光密度(D)值，分析TPL非细胞毒浓度。

1.2.2 TPL对K562/A02细胞多柔比星敏感性的影响 采用“1.2.1”MTT方法，检测不同浓度多柔比星联合TPL或单独作用下，K562/A02细胞的存活率。为避免TPL自身诱导凋亡对实验的影响，TPL采用非细胞毒浓度。实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 按 Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书进行操作。收集对数生长期细胞，以每孔5×105个接种于6孔板中，对照组给予3 μg/ml多柔比星，实验组给予3 μg/ml多柔比星联合TPL，作用24 h，弃培养基，4℃预冷PBS洗涤2次，1 000 r/min离心，1×106/ml的密度重悬细胞于100 μl的1×结合缓冲液中，加入5 μl AnnexinV和10 μl PI染液，轻轻混匀，避光室温反应15 min，再加入300 μl上述缓冲液，于1 h内置流式细胞仪检测。AnnexinV(+)/PI(－)为凋亡细胞，双染色阳性为坏死细胞或凋亡晚期细胞。

1.2.4 荧光定量PCR检测microRNA21表达 依据TRIzol试剂盒说明书，提取细胞内总RNA。以U6为内参，采用SYBR Green实时荧光定量PCR法检测细胞内microRNA21的表达水平［7］。实验重复3次。

1.2.5 microRNA21模拟物及抑制剂转染 microRNA21模拟物和抑制剂均由上海吉玛制药技术有限公司化学合成。microRNA21抑制剂的序列为5'-TCAACATCAGTCTGATAAGCTA-3';microRNA21模拟物序列为5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'。收集对数生长期K562及K562/A02细胞，以每孔4 ×105个接种于 6 孔板中，置 37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h，依据试剂盒说明利用脂质体2000分别将microRNA21模拟物、抑制剂转染到K562和K562/A02细胞中。转染24 h后，TRIzol法提取总RNA，荧光定量PCR检测转染后细胞中microRNA21的表达，并进行多柔比星药物敏感度检测;转染72 h后，蛋白质印迹法检测Bcl-2蛋白表达。

1.2.6 蛋白质印迹法检测Bcl-2蛋白水平 收集细胞，预冷的PBS洗涤细胞2次，加入细胞裂解液，作用1 min，收集细胞裂解物10 000 r/min离心5 min，用Bio-Rad蛋白试剂盒测定浓度。等量蛋白(每孔25 μg)用12%SDS-PAGE电泳分离，100 V电转2 h置硝酸纤维素膜，在含有0.1%Tween-20的5%脱脂奶粉中，室温封闭1h。Bcl-2和GAPDH一抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min。二抗室温孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，加入ECL发光试剂，摄影，对图片进行灰度扫描。

1.2.7 统计学分析 实验至少重复3次。SPSS12.0软件进行统计分析，结果以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析和两组资料比较的t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TPL的细胞毒性作用

不同浓度的雷公藤甲素分别作用于K562和K562/A02细胞株72 h，MTT检测活细胞数。从图1可以看到，在 TPL浓度为 5 nmol/L时，TPL对K562/A02细胞的存活率没有明显影响。因此，采用5 nmol/L作为后续实验的TPL浓度。

图1 TPL对K562和K562/A02细胞的毒性Fig 1 Inhibition of triptolide to K562 and K562/A02 cell lines

2.2 TPL对K562/A02细胞多柔比星敏感性的影响

MTT实验结果提示，相对于多柔比星单独处理组，5 nmol/L TPL联合不同浓度多柔比星作用于细胞72 h后，能够明显增强K562/A02细胞对多柔比星的敏感性(图2A)。AnnexinV/PI双染色定量检测结果显示5 nmol/L TPL联合多柔比星作用与3 μg/ml多柔比星单独作用相比，K562/A02细胞平均凋亡率由 4.3% 明显上升到 18.5%(t=4.3，P ＜0.05)，见图2B ～D。

图2 TPL对K562/A02细胞多柔比星敏感性的影响Fig 2 Reversal of doxorubicin resistance in vitro by triptolide

2.3 TPL对 K562/A02细胞 microRNA21和 Bcl-2表达的影响

荧光定量 PCR检测microRNA21表达水平，U6RNA作为内参;蛋白质印迹法检测Bcl-2蛋白表达水平。结果显示，5 nmol/L TPL作用后，K562/A02细胞中microRNA21、Bcl-2蛋白表达水平较未处理组明显降低(t=5.12，P ＜0.05)，见图 3。

图3 TPL对K562/A02细胞株microRNA21及Bcl-2表达的影响Fig 3 Down-regulation of microRNA21 and Bcl-2 expression by triptolide

2.4 microRNA21对K562/A02细胞多柔比星敏感性的影响

为进一步证明microRNA21在白血病耐药形成中的作用，分别将microRNA21模拟物和 microRNA21抑制剂转染到K562和K562/A02细胞中，图4A、4B显示，转染microRNA21模拟物能升高K562细胞microRNA21表达;而转染了microRNA21抑制剂后，K562/A02细胞microRNA21表达明显下降;转染阴性对照(NC)无明显变化。细胞增殖实验提示，转染microRNA21模拟物后，K562细胞对多柔比星敏感性减低，细胞凋亡减少;而转染了microRNA21抑制剂后，K562/A02细胞对多柔比星敏感性明显增高，细胞凋亡增多(图4C、4D)。

图4 microRNA21对K562/A02细胞多柔比星敏感性的影响Fig 4 Effect of microRNA21 on doxorubicin sensitivity

2.5 microRNA21对 K562/A02细胞中 Bcl-2表达的影响

蛋白质印迹检测结果显示，转染阴性对照(NC)对Bcl-2表达无明显变化;而转染microRNA21抑制剂组，Bcl-2表达显著降低，转染了microRNA21模拟物的K562细胞中Bcl-2蛋白水平明显增高(图5)。

图5 microRNA21对K562/A02细胞中Bcl-2表达的影响Fig 5 Effect of microRNA21 on Bcl-2 expression

3 讨论

化疗是白血病治疗所不可缺少的一项措施。然而，随着多药耐药的日趋产生，白血病复发率明显增高。白血病多药耐药产生机制十分复杂，其中抗凋亡机制尤为重要［6］。几乎所有的化疗药物都是通过诱导细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用［8］。多药耐药的产生可能是白血病细胞通过表达一种抗凋亡蛋白(如 Bcl-2)诱导凋亡的作用［9］。

Bcl-2是细胞凋亡机制中的一种关键调节蛋白，是抑制凋亡的关键分子，在许多肿瘤中过表达，造成肿瘤的多药耐药。Bcl-2除了受转录因子和蛋白酶的调节作用外，近来，有人发现在肿瘤细胞中，Bcl-2的表达水平还受microRNA的影响，其中microRNA21 备受关注［10］。

MicroRNAs(miRNAs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA。成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的［4］。据推测，人类基因组可能存有1 000多种miRNA基因，目前已知700多种，约1/3的蛋白编码基因受miRNA调控。近来，越来越多的研究发现，miRNA与众多肿瘤的多药耐药密切相关。microRNA21是一种致癌基因，在多种肿瘤中过表达，如肺癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌和胶质母细胞瘤等［11］。microRNA21能下调视网膜母细胞瘤Ⅰ(RBI)，转移生长因子β受体Ⅱ(TGFBR2)、程序性死亡基因4(PDCD4)等抑癌基因的表达，从而促进癌细胞增殖［12］。Bai等［13］的研究发现microRNA21在白血病耐药中起关键作用。Meng等［14］证实，胆管癌患者存在 microRNA21过表达现象，并且这种过表达导致患者对吉西他滨不敏感。Si等［15］发现，用反义核酸技术下调microRNA21可以增强 MCF-7细胞对拓扑替康的敏感性，这可能是由于抑制microRNA21造成Bcl-2蛋白的低表达，从而促进了细胞凋亡。Dong等［16］发现microRNA21直接作用于Bcl-2，并上调其表达。然而，关于microRNA21与白血病多药耐药的报道较少。本研究发现，多柔比星耐药的K562/A02细胞中microRNA21高表达，提示miRNA与白血病多药耐药有关，microRNA21可作为逆转或预防白血病多药耐药的治疗靶点。

雷公藤甲素又名雷公藤内酯醇，是临床上应用的各种雷公藤制剂的主要活性成分。近来，大量研究发现TPL是一种广谱的肿瘤抑制剂［17］。最近，陆续有研究报道TPL可以增强化疗药物的细胞毒作用。Chen等［18］发现，雷公藤甲素能够提高5-氟尿嘧啶对KB细胞的抗肿瘤活性。

本实验首先检测了TPL对K562/A02及K562细胞的毒性。采用非细胞毒性浓度的TPL(5 nmol/L)作用于K562/A02细胞72 h后，可以显著增强其对多柔比星的化疗敏感性，K562/A02细胞中microRNA21表达水平明显下降。进一步研究显示，伴随着microRNA21水平的下降，Bcl-2蛋白表达水平也降低。

综上所述，本研究发现TPL可以提高慢性髓系白血病耐药细胞K562/A02对多柔比星化疗敏感性，其机制可能是通过下调microRNA21及其靶基因Bcl-2来促进多柔比星诱导的细胞凋亡所实现的，这为临床白血病多药耐药的逆转治疗提供了新的思路。

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