TGF-β1诱导人肝HL7702细胞发生上皮细胞间质转化的实验研究

李婷芬，王冰莹，严永敏，李里明，蒋留留，钱晖

(江苏大学基础医学与医学技术学院，江苏镇江212013)

肝纤维化是一种肝脏正常结构破坏，胶原沉积的过程［1］，目前肝纤维化的发病机制尚有争议。TGF-β1 是上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchyme transition，EMT)最重要的调节分子，Zeisberg 等［2］发现小鼠肝纤维化中成纤维细胞来源于局部肝细胞经TGF-β1作用发生EMT，骨形成蛋白7(BMP7)抑制EMT后，相应肝纤维化也得到修复。Kaimori等［3］把小鼠原代肝细胞和小鼠肝细胞系AML12做了对比，发现 TGF-β1会诱导成熟的小鼠肝细胞发生EMT转变。Chen等［4］也发现体外 TGF-β1诱导小鼠肝细胞发生EMT转变。但是人肝脏纤维化与EMT关系的研究还未见报道。

本实验旨在探讨人肝细胞系HL7702在TGF-β1诱导下是否发生EMT，并检测EMT相关基因蛋白的表达变化，为进一步研究EMT和肝纤维化之间的具体机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人肝细胞HL7702购自中国科学院细胞库。

1.1.2 主要试剂 1640培养基，小牛血清(Gibco公司);人类重组TGF-β1(Peprotech公司);兔抗人多克隆E-钙黏附蛋白抗体(SAB公司);鼠抗人多克隆N-钙黏附蛋白抗体(BD公司);鼠抗人多克隆波形蛋白抗体(Santa cruz公司);鼠抗多克隆GAPDH抗体，羊抗鼠IgG，羊抗兔IgG(上海康成公司);Trizol试剂(Invitrogen公司)，RT-PCR试剂盒(MBI公司)，SYBR Green荧光染料(ToYoBo公司)。

1.1.3 主要仪器 二氧化碳培养箱(Forma，Scientific公司)，倒置式生物显微镜(Ti，Nikon公司)，PCR仪(2720，ABI公司)，荧光定量 PCR分析仪(CFX96TM，Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 TGF-β1 刺激人肝细胞 HL7702 HL7702 于20%小牛血清(1640)培养基37℃ 5%CO2孵箱中培养，每3天换1次营养液。消化传代后HL7702分别种于6孔板，细胞浓度为1×107/孔。20%小牛血清(1640)营养液培养2 d后，撤除营养液换成无血清1640 培养基和 TGF-β1 2 ng/ml培养 24，48，72 h后，通过倒置显微镜观察诱导前后细胞的形态变化。

1.2.2 实时定量PCR检测EMT相关基因 用Trizol试剂提取诱导前后细胞总RNA，以总RNA为模板，Oligo dT为引物，逆转录合成cDNA，以cDNA为模板，qRT-PCR检测相关基因的表达量，各引物序列见表 1。qRT-PCR反应体系:10 μl 2 ×SYBR Green 荧光染料，引物1 和引物2 各0.5 μl，Taq DNA聚合酶 0.1 μl，1 μl cDNA，补水至总体积 20 μl。循环35 次:94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s，E-钙黏附蛋白(80℃)，N-钙黏附蛋白，Twist(75℃)，β-肌动蛋白(78℃)采集荧光;随后72℃延伸5 min，最后进行72℃ ～99℃的熔解曲线分析。E-钙黏附蛋白、N-钙黏附蛋白、Twist的数据与β-肌动蛋白数据采用相对比值法处理。

表1 引物碱基序列Tab 1 Primer sequence

1.2.3 蛋白质印迹法检测EMT相关蛋白 诱导组及未诱导组细胞经裂解液充分裂解后，加入等体积5×SDS上样缓冲液于蛋白裂解上清液中，煮沸5 min。进行聚丙烯酰胺电泳，每孔上样等量总蛋白。分离的蛋白转移至PVDF膜上，5% 脱脂牛奶室温封闭1 h后，加入E-钙黏附蛋白(1∶200)、N-钙黏附蛋白(1∶2 000)、波形蛋白(1 ∶500)及GAPDH(1∶10 000)抗体稀释液，4℃过夜。TBS/0.5%Tween20洗膜3次后，再加入1∶5 000抗HRP抗体稀释液37℃ 孵育1 h，TBS、0.5%Tween20充分洗膜3次后，用预混HRP化学发光底物(Luminata crescendo western HRP substrate)检测蛋白。

1.3 数据处理及统计

实验数据用GraphpadPrism 5软件进行统计学分析，组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HL7702细胞诱导前后的形态学变化

体外培养的HL7702细胞的形态是不规则的六边形，经TGF-β1诱导24 h后细胞形态基本没有变化，48 h后少量的细胞拉长变成纺锤形，72 h后细胞形态的变化很明显，大量的细胞完全变成纺锤形，细胞之间的间隙也变大(图1)。

2.2 TGF-β1诱导后HL7702细胞EMT相关基因表达

通过观察细胞形态学的变化，选择72 h的细胞提取总RNA用于定量分析，结果显示HL7702细胞经诱导72 h后E-钙黏附蛋白mRNA的表达较对照组明显减少，差异有统计学意义(t=3.353，P＜0.05)。而 N-钙黏附蛋白，Twist mRNA 的表达较对照组 HL7702显著增加(t=3.850，P＜0.05;t=5.433，P ＜0.05)。见图2。

图1 TGF-β1诱导前后HL7702细胞的形态学变化(×100)Fig 1 Morphology changes after TGF-β1 induction in HL7702 cells

图2 TGF-β1诱导后HL7702细胞EMT相关基因mRNA的表达Fig2 Relative EMT-associated gene expression level after TGF-β1 treatment in HL7702 cells

2.3 TGF-β1诱导后HL7702细胞EMT相关蛋白表达

蛋白质印迹结果显示，HL7702诱导24 h和48 h后E-钙黏附蛋白基本没什么变化，72 h后E-钙黏附蛋白表达明显减弱(P＜0.001)。而N-钙黏附蛋白、波形蛋白均随诱导时间的延长表达明显增强。见图3。

3 讨论

TGF-β1是一组具有多种功能的蛋白多肽，对细胞的增殖分化、细胞外基质(ECM)形成、组织损伤修复起着重要作用［5］。TGF-β1是肝脏中最主要的成分，随着对TGF-β1认识逐步加深，人们发现肝纤维化与TGF-β1有重要的联系。本研究采用TGF-β1作用于人肝细胞系HL7702之后，通过细胞形态学变化，EMT相关基因和蛋白表达分析，证明了肝细胞HL7702经过TGF-β1诱导后确实发生了EMT，上皮化标记E-钙黏附蛋白显著下降，间质化标记N-钙黏附蛋白、波形蛋白和 Twist显著增加。肝细胞渐渐失去了上皮细胞的特性和功能。

E-钙黏附蛋白、N-钙黏附蛋白、波形蛋白和 Twist是EMT的重要检测指标，TGF-β1广泛用于EMT的诱导［2-4］。相关研究已表明TGF-β1诱导小鼠的原代肝细胞和肝细胞系发生EMT之后，上皮化标记E-钙黏附蛋白下降，间质化标记N-钙黏附蛋白和波形蛋白显著增加［3-4］，这说明细胞失去了上皮化特性和功能，具有间质化细胞的特性和分泌胶原的功能。在小鼠体内纤维化的实验中，小鼠肝内大量的成纤维细胞也是由肝细胞经过EMT而来，促使肝纤维化中胶原的形成［2］。研究发现 TGF-β1诱导上皮细胞发生EMT的机制与Snail-1转录因子有关。Snail-1转录因子是EMT发生的关键分子［6-8］，TGF-β1激活 Snail-1与E-钙黏附蛋白转录的抑制有关系，Snail-1是间质化标记波形蛋白的上游分子［9］。Kaimori等［3］发现用Smad4-siRNA干扰小鼠肝细胞后抑制了TGF-β1诱导EMT和Ⅰ型胶原的表达，且依然保留上皮化表型 (E-钙黏附蛋白)和功能(白蛋白)。

图3 TGF-β1诱导后HL7702细胞EMT相关蛋白表达Fig3 Expression of EMT-associated proteins after TGF-β1 induced in HL7702 cells

Snail-1是EMT的关键分子，那么如果封闭Snail-1转录因子之后，是否会抑制TGF-β1诱导人肝细胞发生EMT?TGF-β1/Smads信号通路是EMT发生的重要信号通路，那么Smad4-siRNA干扰之后，即使肝细胞在TGF-β1作用下也不会发生EMT吗?这些问题将是在此基础上我们今后要研究的内容。

［1］Friedman SL.Mechanisms of hepatic fibrogenesis［J］.Gastroenterology，2008，134(6):1655-1669.

［2］Zeisberg M，Yang C，Martino M，et al.Fibroblasts derive from hepatocytes in liver fibrosis via epithelial to mesenchymal transition［J］.J Biol Chem，2007，282(32):23337-23347.

［3］Kaimori A，Potter J，Kaimori JY，et al.Transforming growth factor-beta1 induces an epithelial-to-mesenchymal transition state in mouse hepatocytes in vitro［J］.J Biol Chem，2007，282(30):22089-22101.

［4］Chen YL，Lv J，Ye XL，et al.Sorafenib inhibits transforming growth factor β1-mediated epithelial-mesenchymal transition and apoptosis in mouse hepatocytes［J］.Hepatology，2011，53(5):1708-1718.

［5］郭锐芳，杨少奇.以TGF-β1为靶点的抗肝纤维化治疗［J］.实用肝脏病杂志，2008，11(5):341-343.

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［8］Carver EA，Jiang R，Lan Y，et al.The mouse snail gene encodes a key regulator of the epithelial-mesenchymal transition［J］.Mol Cell Biol，2001，21(23):8184-8188.

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