不同发育阶段恒牙牙髓组织中VEGF及受体的表达

关为群，王清妹

(福建医科大学附属协和医院口腔科，福建福州350001)

在牙髓再生组织工程中，诱导血管再生是牙髓再生的关键。目前，诱导血管生成作用的因子有血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子，血小板源性生长因子，转化生长因子α、β，肿瘤坏死因子，其中VEGF是血管生成最强有效的诱导者［1］。VEGF是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，它与体内血管的形成及其渗透性的调节密切相关，VEGF生物学功能的发挥归功于其对VEGF受体的识别，其中VEGFR-1/Flt-1介导血管内皮基底细胞渗透性的调节，VEGFR-2/Flk-1介导血管内皮细胞的增殖分化及渗透性的调节，VEGFR-3介导淋巴管的形成［2-3］。人牙髓组织中也存在少量 VEGF［4］，但在人恒牙不同发育阶段牙髓组织VEGF的表达是否存在差异，且牙齿发育不同阶段VEGF发挥效用是否也是通过识别不同的受体Flt-1或Flk-1而实现，这是牙髓生理学中值得关注的问题。本实验的目的是通过组织和分子水平了解VEGF、Flt-1、Flk-1在人年轻恒牙和成熟恒牙牙髓组织的表达，为下一步应用组织工程将VEGF及其受体作为干预因子导入不同发育阶段牙髓组织内，治疗牙髓疾病提供新的思路和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

研究对象为福建医科大学附属协和医院口腔科门诊就诊患者，取因正畸治疗需要而拔除的健康前磨牙，参照文献［5］恒牙牙根发育的阶段划分法，结合X线片及患者年龄，将受试牙分为根尖孔开放的年轻恒牙和根尖孔闭合的成熟恒牙各15例，所有牙体均无龋病，无畸形中央尖，牙周组织健康，患者无系统性疾病，研究获得患者本人或家属的知情同意。年轻恒牙组年龄为10～14岁，成熟恒牙组年龄20～25岁，男女均有。

1.2 免疫组化染色

1.2.1 标本制备 按牙体脱钙法进行标本制备［6］，经常规标本脱水石蜡包埋(图1)，每个标本于牙髓长轴最大体积处连续切片，厚约5 μm，取5张分别用于 HE染色，VEGF、Flt-1、Flk-1免疫组化染色及阴性对照。

图1 不同发育阶段恒牙牙根Fig 1 The root of different developmental phase of permanent teeth

1.2.2 免疫组化染色 采用常规SP法，DAB显色，以PBS代替一抗作为阴性对照，口腔牙周组织阳性染色片作为阳性对照。兔抗人Flt-1，Flk-1多克隆抗体(福州迈新生物技术公司)和兔抗人VEGF单克隆抗体(北京中杉试剂公司)的工作浓度均为1∶100。

1.2.3 图像分析 镜下(×400)每张切片随机选取5个视野，利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对阳性染色部位的平均光密度(D)值进行定量分析，以同张切片的空白区进行校正。5个视野的均值为该样本的最终D值。染色强度与D值大小成正比。

1.3 实时荧光定量逆转录聚合酶反应(RT-PCR)

1.3.1 RT-PCR 标本制备 参照 Tjaderhane等［7］的方法，将新鲜的离体牙置于无菌Hanks液保存，距釉牙骨质界根方3 mm将冠根分开，置于无菌Hanks液中，用镊子和探针小心取出牙髓，用无菌小挖匙刮下髓腔壁的成牙本质细胞，将取出的牙髓组织和成牙本质细胞置于加入少量Trizol离心管中，以防止组织RNA降解，收集好的标本-80℃冰箱中保存待检。

1.3.2 RT-PCR反应 提取牙髓组织总RNA，测定纯度定量后按照Qiagen公司逆转录试剂进行逆转录。PCR反应引物由上海康成生物工程公司合成。内参照GAPDH(299 bp)F:5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，R:5'-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3';VEGF(145 bp)F:5'-AGGGAAGAGGAGGAGATGAG-3'，R:5'-GCTGGGTTTGTCGGTGTT-3';Flt-1(169 bp)F:5'-GCAACAAGCCCGTTAGCC-3'，R:5'-CCCACATGGTGCGTCTCA-3';Flk-1(162 bp)F:5'-CCAATAATCAGAGTGGCAGTG-3'，R:5'-CATAGACATAAATGACCGAGGC-3'。反应体系:10 ×PCR缓冲液 2.5 μl，dNTP 2.5 μl，Taq 聚合酶 1 U，10 μmol/L 的 PCR 特异引物 F 1 μl，10 μmol/L 的 PCR特异引物 R 1 μl，cDNA1 μl，ddH2O 30 μl。反应条件为 GAPDH:95℃，5 min;35个PCR循环(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;83℃收集荧光，5 s)，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5 s升高1℃)建立 PCR产物的熔解曲线。VEGF:95℃，5 min;35 个 PCR 循环(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;84℃收集荧光，5 s)，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR产物的熔解曲线。Flt-1:95℃，5 min;35个 PCR循环(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;83℃收集荧光，5 s)，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR产物的熔解曲线。Flk-1:95℃，5 min;35 个 PCR 循环(95℃，10 s;59℃，15 s;72℃，20 s;81.5℃收集荧光，5 s)，扩增反应结束后继续从72℃缓慢加热到99℃(每5 s升高1℃)建立PCR产物的熔解曲线。在指数增长期，得到的产物才和循环数有线性的关系，可进行半定量RTPCR分析。PCR产物1.5%琼脂糖凝胶电泳。

1.4 统计分析

采用SPSS17.0统计软件对测定结果进行分析，实验数据以均数±标准差(±s)表示，应用两独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙髓组织VEGF、Flt-1、Flk-1免疫组化染色

VEGF表达于细胞的胞质或胞膜上，在牙髓血管内皮细胞、成牙本质细胞、成纤维细胞和基质细胞中都有表达。其中血管内皮细胞呈条索状强阳性染色，其他细胞中呈絮状、线状或颗粒状表达。Flt-1，Flk-1主要表达于血管内皮细胞胞质中。牙髓中Flt-1，Flk-1的表达均弱于VEGF(图2)。

图2 不同发育阶段恒牙牙髓VEGF及受体的组织学表达Fig 2 Histological expression of VEGF，Flt-1，Flk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth

2.2 年轻恒牙和成熟恒牙牙髓VEGF，Flt-1，Flk-1的D值分析

两独立样本 t检验，得出年轻恒牙组牙髓VEGF，Flk-1表达比成熟恒牙组的高(P ＜0.05)，而Flt-1的表达比成熟恒牙组中的低(P＜0.05)见表1。

表1 年轻恒牙和成熟恒牙牙髓VEGF，Flt-1，Flk-1阳性染色D值Tab 1 The positive dyeing D value of VEGF，Flt-1，Flk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth n=15

2.3 VEGF 、Flt-1、Flk-1 mRNA 的表达

以年轻恒牙和成熟恒牙牙髓标本总RNA进行RT-PCR，琼脂糖凝胶电泳显示年轻恒牙和成熟恒牙牙髓标本均在145 bp，162 bp，169 bp位置出现条带，与预期扩增产物大小一致(图3)。

VEGF、Flt-1、Flk-1基因相对含量见表2。结果提示:年轻恒牙VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的表达分别是成熟恒牙的1.7倍、0.6倍和1.5倍。

表 2 VEGF、Flt-1、Flk-1 mRNA 相对含量Tab 2 The relative content of VEGF，Flt-1，Flk-1 mRNA

图3 RT-PCR检测VEGF，Flt-1，Flk-1在年轻恒牙和成熟恒牙中的分子水平表达情况Fig 3 Molecule level expression of VEGF，Flt-1，Flk-1 in the pulp of young and mature permanent teeth

3 讨论

牙髓是一种疏松结缔组织，位于由牙本质所形成的髓腔内，包含细胞、纤维、神经、血管、淋巴管和其他细胞外基质。牙髓的主要功能是形成牙本质、营养、感觉、防御及修复。牙本质修复过程中血管源性生长因子可诱导局部新生血管形成，是牙本质成功修复的关键，其中VEGF是血管生成最强而有效的诱导剂，它通过与VEGF受体的识别后发挥作用。在VEGF受体中，Flt-1与VEGF的亲和力比Flk-1高10倍［8］，但不能激活内皮细胞增殖的信号，可能是作为VEGF促血管生成的反向调节因子发挥作用。VEGF刺激内皮细胞的增殖、增加血管的通透性和新血管的生成作用主要是通过结合和激活Flk-1来实现的［9］。本实验免疫组化结果显示年轻恒牙和成熟恒牙牙髓组织中均有VEGF、Flt-1、Flk-1免疫反应阳性细胞，且VEGF与Flk-1在年轻恒牙中的表达明显高于成熟恒牙，说明在促进年轻恒牙根尖发育过程中VEGF能通过与Flk-1结合而发挥诱导人牙髓细胞增殖分化成成牙本质细胞和促进修复性牙本质的形成。而发育成熟的恒牙牙髓组织形成血管相关因子VEGF原有的基础表达量不足，同时Flt-1表达相对年轻恒牙增强，竞争性地阻抗VEGF与Flk-1的结合，双重作用的结果导致其牙髓组织血管合成能力的下降，修复性牙本质的修复能力相对年轻恒牙弱。

RT-PCR检测结果进一步证实年轻恒牙VEGF及其受体Flt-1、Flk-1的表达分别是成熟恒牙的1.7倍及0.7倍、1.3倍，提示年轻恒牙牙髓 VEGF、Flt-1、Flk-1的表达与成熟恒牙存在差异，反映了年轻恒牙牙髓组织血管再生潜力高于成熟恒牙，临床对年轻恒牙的牙髓修复干预可能可以通过调节VEGF和Flk-1的表达这一新的途径得以实现。而对成熟恒牙的牙髓修复可能通过增强VEGF或降低Flt-1的表达来干预。已有研究表明VEGF/VEGFR家族信号转导途径受多种因素影响，如一个特定的环境，内皮基膜，周围支持细胞的浓度都可以影响内皮细胞的表型和功能乃至VEGF/VEGFR的生物学效应，血流很可能是激活VEGF/VEGFR的另一个重要因素［10］。年轻恒牙中牙髓血供丰富，脉管管腔大而多，基质细胞充满整个组织间隙且根尖呈开放状，有利于牙髓内外血供交流，可能是其血管再生潜力高于成熟恒牙的重要因素。

最大限度地保存牙髓的活力或促进牙髓的再生，是目前牙体牙髓病治疗过程中追求的目标。对不同年龄及不同牙髓状态中VEGF及其相关受体表达的研究，提示将来临床上利用牙髓组织工程治疗不同牙髓状态的牙髓疾病时，可以依治疗需要，将外源性VEGF及相关受体加入到支架和牙髓细胞的复合体中，促进血管再生、参与调节纤维原细胞的分化和神经纤维的生长，最终诱导牙髓完全性修复牙本质的形成［11］;或是利用基因技术，将人VEGF及受体基因转入种子细胞(如牙髓干细胞或成纤维细胞)，使种子细胞持续产生VEGF和相关受体，为修复性牙本质形成提供足够的血管化并调节细胞的活性，从而达到治愈牙髓病的目的，这需进一步的动物实验和临床验证研究［12］。

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