鼠IFN-λ2腺病毒载体的构建及鉴定

刘洋，袁利学，步雪峰，严玉兰

(1.江苏大学附属人民医院呼吸科，江苏镇江212002;2.黄石市中心医院重症医学科，湖北黄石435000)

2003 年 Sheppard等［1］和 Otenko等［2］相继报道了 IFN-λ 家族，包括 IFN-λ1、IFN-λ2 和 IFN-λ3 3 个成员(又称IL-29、IL-28A 和IL-28B)。IFN-λs具有与Ⅰ型干扰素类似的信号转导通路，从而发挥抗病毒、抗细胞增殖和免疫调节等生物学作用［3］。近来众多研究表明IFN-λs在体内外均具有抗肿瘤细胞生长作用［4－6］。因此，本实验构建鼠 IFN-λ2 重组腺病毒载体，为后续进一步开展抗肿瘤的研究及基因治疗奠定良好的基础。

1 材料和方法

1.1 材料

引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;内切酶购自TaKaRa公司;T4DNA连接酶购自MBI公司。质粒中量提取试剂盒购自Qiagen公司;转染试剂LipofectaminTM2000购自Invitrogen公司;pShuttle-CMV载体、腺病毒的骨架载体、BJ5183菌、pAdEasy，人胚肾293A细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供。LA795鼠肺腺癌细胞购自北京协和细胞资源中心。

1.2 方法

1.2.1 鼠脾脏细胞制备 BALB/c鼠1只，无菌取出脾脏，剥离结缔组织，用不完全培养液清洗后将脾脏经200目纱网研磨过滤成单个细胞，将脾细胞悬液移至离心管中，800 r/min离心10 min，沉淀用不完全培养液再离心洗涤1次，将细胞沉淀用含5%胎牛血清的DMEM重悬，移至细胞培养瓶，37℃ 5%CO2培养箱培养。

1.2.2 引物设计 按基因库报告的mIFN-λ2基因全长序列设计引物，上游引物:5'-GGTACCATGCTCCTCCTGCTGTTGCCTCTGCTGCTGGCCGC-3'，下游引物:5'-AAGCTTTCAGACACACTGGTCTCCACTGGCCACACAC-3'上游引物中引入KpnⅠ位点，下游引物中引入HindⅢ位点。

1.2.3 鼠IFN-λ2基因的RT-PCR克隆 用人水疱口炎病毒按感染复数(multiplicity of infection，MOI)1.0感染鼠脾脏细胞12 h后，Trizol法提取小鼠脾脏细胞的总RNA，以Oligod T为反转录引物用Invitrogen反转录试剂盒反转录成cDNA模板进行PCR，PCR的循环条件:95℃ 热启动预变性5 min，95℃30 s，58℃ 30 s，72 ℃50 s，共 30 个循环，72 ℃ 延伸10 min，对扩增产物进行10 g/L琼脂糖电泳分析。

1.2.4 鼠IFN-λ2基因亚克隆入腺病毒穿梭载体将鼠IFN-λ2 cDNA的PCR产物用胶回收试剂盒回收，用T4DNA连接酶将上述回收的PCR产物与PMD18-T载体连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5α，挑取阳性克隆，送上海生物工程有限公司测序。将测序正确的mIFN-λ2-PMD18-T载体质粒用KpnⅠ、HindⅢ双酶切并用胶回收试剂盒回收，pShuttle-CMV载体用KpnⅠ、HindⅢ双酶切处理后胶回收，将两者用T4DNA连接酶连接并转化至感受态大肠埃希菌DH5α，挑取阳性克隆，并进行酶切鉴定。

1.2.5 同源重组腺病毒质粒的构建 将重组的腺病毒穿梭质粒 pShuttle-CMV-mIFN-λ2用 PmeⅠ37℃单酶切2 h线性化后，用琼脂糖电泳鉴定后胶回收线性化的重组质粒;将BJ5183感受态细胞融解，将线性化的穿梭质粒及病毒骨架质粒pAdEasy-1加入BJ5183感受态细胞中混匀进行电转化，涂于LB平板，培养过夜;挑取克隆，质粒小提试剂盒法提取质粒，PacⅠ单酶切进行鉴定。将鉴定正确的重组腺病毒质粒转化DH5α菌中大量制备。

1.2.6 重组腺病毒的包装和扩增 将构建的pAdmIFN-λ2同源重组腺病毒质粒经PacⅠ酶线性化酶切后，割胶回收大片段，按LipofectamineTM2000操作说明分别转染293A人胚肾细胞中进行包装。通过显微镜观察细胞病理改变，出现明显细胞病变效应(CPE)时(++～+++)，将细胞悬液反复冻融3次，取第1代重组腺病毒提取基因组进行PCR鉴定，检测重组腺病毒中是否插入目的基因mIFN-λ2。此第1代重组腺病毒粗提液在293A细胞中经多轮感染和扩增后获得较高滴度的pAd-mIFN-λ2重组腺病毒，于－70℃保存待用。

1.2.7 pAd-mIFN-λ2 病毒滴度的测定 采用半数细胞感染量(TCID50)方法测定pAd-mIFN-λ2病毒滴度，即根据病毒稀释到终点时，在293A细胞中细胞病变效应(CPE)的发生来估算病毒滴度。

1.2.8 蛋白质印迹法检测mIFN-λ2蛋白的表达将处于对数生长期鼠肺腺癌LA795细胞种植于6孔板内，浓度为1×105/孔，37℃，5%CO2培养过夜。次日换用无血清 DMEM ，用 pAd-mIFN-λ2及 pAd-LacZ腺病毒以相同的稀释比例(1∶200)分别感染LA795细胞，分为4组:细胞对照PBS组、pAd-LacZ组(3×108pfu/ml)、pAd-mIFN-λ2 组(3 ×108pfu/ml)、pAd-mIFN-λ2 组(2 ×1010pfu/ml)，感染48 h收集上清，冷冻干燥后，提取蛋白，行SDS-PAGE，转膜后使用羊抗鼠IL-28为一抗，兔抗羊IgG-HRP为二抗进行蛋白质印迹检测。

1.2.9 倒置显微镜观察pAd-mIFN-λ2对鼠肺腺癌细胞生长的抑制作用 将处于对数生长期鼠肺腺癌细胞LA795种植于6孔板内，浓度为1×105/孔，次日换含2%胎牛血清的DMEM维持液，分为3组:细胞对照组，pAd-LacZ 组、pAd-mIFN-λ2 组，在实验组分别加入3×108pfu/ml的pAd-LacZ及pAd-mIFN-λ2 100 μl，72 h后倒置显微镜观察鼠肺腺癌细胞的生长情况。

2 结果

2.1 mIFN-λ2 的 RT-PCR 扩增产物鉴定

经人水疱口炎病毒诱导小鼠脾脏细胞mRNA表达并用RT-PCR扩增。其产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，出现大小约为582 bp的条带，与所需克隆的mIFN-λ2基因大小相一致(图1)。

图1 mIFN-λ2的RT-PCR扩增产物Fig 1 Product of mIFN-λ2 amplified by RT-PCR

2.2 pMD18-T-mIFN-λ2 的酶切鉴定

将菌落PCR鉴定阳性的克隆扩增后，提取质粒pMD18-T-mIFN-λ2，用KpnⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定，出现约582 bp大小条带，与目的基因大小完全一致(图2)。

图2 pMD18-T-mIFN-λ2的酶切鉴定Fig 2 Identification of pMD18-T-mIFN-λ2 cutted by enzyme

2.3 pMD18-T-mIFN-λ2 的测序

取酶切鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果与基因库中的mIFN-λ2序列完全一致。

2.4 pShuttle-CMV-mIFN-λ2 KpnⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定

挑取阳性克隆感受态大肠埃希菌DH5α，进行KpnⅠ、HindⅢ双酶切，将酶切产物进行核酸电泳分析，出现约582 bp大小的条带，与目的基因大小完全一致(图3)。

图3 pShuttle-CMV-mIFN-λ2 的KpnⅠ、Hind Ⅲ双酶切鉴定Fig 3 Identification of pShuttle-CMV-mIFN-λ2 cutted by enzymes KpnⅠ、Hind Ⅲ

2.5 pAd-mIFN-λ2腺病毒质粒重组子PacⅠ酶切鉴定

重组腺病毒质粒pAd-mIFN-λ2经PacⅠ酶切后，得到两条基因片段，长度分别约为4.5 kb和30 kb(图4)。以重组腺病毒质粒 pAd-mIFN-λ2为模板，PCR鉴定结果如图5，可见约582 bp大小的条带，与目的基因大小完全一致。

图4 重组腺病毒质粒pAd-mIFN-λ2酶切鉴定图Fig 4 Identification of recombinant adenovirus plasmid pAd-mIFN-λ2 cutted by enzyme

图5 PCR鉴定重组腺病毒质粒pAd-mIFN-λ2Fig 5 Identification of recombinant adenovirus plasmid pAd-mIFN-λ2 using PCR

2.6 重组腺病毒pAd-mIFN-λ2的鉴定

提取转染pAd-mIFN-λ2的293A细胞腺病毒基因组，PCR扩增基因内部序列。重组腺病毒扩增出582 bp条带，阴性对照为正常293A细胞处理组，结果证明重组腺病毒带有目的基因(图6)。

图6 PCR鉴定重组腺病毒pAd-mIFN-λ2Fig 6 Identification of recombinant adenovirus pAd-mIFN-λ2 using PCR

2.7 腺病毒感染293A细胞发生细胞病变效应

正常的293A细胞为贴壁细胞，轮廓分明;而重组腺病毒mIFN-λ2感染的293A细胞开始变圆、肿胀，并有一部分悬浮起来，出现脱落和死亡等典型细胞病变效应(图7)。

图7 重组腺病毒感染对293A细胞的影响(×400)Fig 7 Effect to 293A cells infected recombinant adenovirus

2.8 腺病毒滴度的测定

重组腺病毒pAd-mIFN-λ2经过扩增后，我们取第4代和5代病毒采用TCID50方法来测定病毒滴度。第 5 代 pAd-mIFN-λ2 的 病 毒 滴 度 T=1010.9TCID50/ml，即 2 ×1010pfu/ml。

2.9 mIFN-λ2 蛋白的表达

鼠肺腺癌细胞LA795在无血清培养基中培养，各组处理所收集的上清其mIFN-λ2蛋白经蛋白质印迹鉴定，细胞对照PBS组和pAd-LacZ组(3×108pfu/ml)未见 27 000条带，Ad-mIFN-λ2组(3×108pfu/ml)有一很浅的灰色条带，而 pAd-mIFN-λ2组(2×1010pfu/ml)出现1条明显的黑色条带(图8)。

2.10 pAd-mIFN-λ2对鼠肺腺癌细胞生长的抑制作用

分别以3×108pfu/ml的Ad-LacZ及pAd-mIFN-λ2 100μl感染鼠肺腺癌细胞72 h，倒置显微镜下可见对照组细胞生长正常，pAd-LacZ组细胞生长受到轻度抑制，pAd-mIFN-λ2组细胞生长受到明显抑制(图9)。

图8 感染pAd-mIFN-λ2后LA795细胞mIFN-λ2蛋白的表达Fig 8 mIFN-λ2 protein expressing in LA795 cells infected by pAd-mIFN-λ2

图9 pAd-mIFN-λ2对鼠肺腺癌细胞生长的影响(倒置显微镜，×200)Fig 9 Effect of pAd-mIFN-λ2 on the growth of mouse lung adenocarcinoma cells

3 讨论

IFN-λs家族有 3 个成员，即 IFN-λ1(IL-29)、IFN-λ2(IL-28A)、IFN-λ3(IL-28B)。小鼠的 IFN-λ家族基因全长为582 bp，但只有 IFN-λ2与 IFN-λ3两型，因为小鼠IFN-λ1基因的第1个外显子含有一个终止密码子，不能编码蛋白。小鼠的IFN-λ2与IFN-λ3同源性为98%，小鼠的 IFN-λ家族与人的IFN-λ家族同源性为60%［7］。IFN-λ家族低剂量的表达于多种组织文库中，包括血液、大脑、垂体、肺、胰腺、胎盘、卵巢、前列腺和睾丸，也可以通过双链RNA聚肌胞苷酸诱导外周血单核细胞或多种病毒(如水疱口炎病毒、登革热病毒、流感病毒、疱疹病毒、呼吸合胞病毒等)感染肿瘤细胞、淋巴细胞和上皮细胞产生［1－2］。

本实验采用人水疱口炎病毒诱导小鼠原代脾细胞表达 IFN-λ2，通过 RT-PCR 获取 IFN-λ2 的cDNA，基因序列测定表明与基因库公布的序列完全一致。将测序正确的鼠IFN-λ2亚克隆至pShuttle-CMV载体，经PmeⅠ线性化后，与腺病毒的骨架载体pAdEasy在BJ5183菌中同源重组，然后转染293A细胞进行包装及扩增获得鼠IFN-λ2重组腺病毒。RT-PCR证实包装成功的重组腺病毒中含有目的基因鼠IFN-λ2，且病毒滴度较高。将重组腺病毒感染鼠肺腺癌细胞，蛋白质印迹法证实有鼠IFN-λ2蛋白的表达，并能抑制鼠肺腺癌细胞的生长。

基因治疗是一种高效、特异性、靶向性强的治疗方法，主要是将目的基因放进特定的载体导入人体内，在人体细胞中表达特定的蛋白达到治疗的目的。腺病毒是目前基因治疗研究和临床试验中应用最广的病毒载体之一。既往研究表明IFN-λs在体内外均有明显的抗肿瘤作用，且通过调动机体免疫系统在杀伤肿瘤过程中占主导地位，其主要机制是通过激活多形核白细胞、CD8 T细胞、NK细胞并可协同其他细胞因子增强 IFN-γ 的分泌等来杀伤肿瘤细胞［4－6］。鼠IFN-λ2重组腺病毒载体的构建为以后进一步开展体内外的抗肿瘤研究及基因治疗奠定了基础。

［1］Sheppard P，Kindsvogel W，Xu W，et al.IL-28，IL-29 and their class II cytokine receptor IL-28R［J］.Nat Immunol，2003，4(1):63 －68.

［2］Otenko SV，Gallagher G，Baurin VV，et al.IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex［J］.Nat Immunol，2003，4(1):69－77.

［3］Meager A，Visvalingam K，Dilger P，et al.Biological activity of interleukins-28 and-29:Comparison with type I interferons［J］.Cytokine，2005，31(2):109 －118.

［4］Dumoutier L，Tounsi A，Michiels T，et al.Role of the interleukin(IL)-28 receptor tyrosine residues for antiviral and antiproliferative activity of IL-29/interferon-lambda 1:similarities with type I interferon signaling［J］.J Biol Chem，2004，279(31):32269 －32274.

［5］Zitzmann K，Brand S，Baehs S.et al.Novel interferonlambdas induce antiproliferative effects in neuroendocrine tumor cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，2006，344(4):1334－1341.

［6］Sato A，Ohtsuki M，Hata M，et al.Antitumor activity of IFN-lambda in murine tumor models［J］.J Immunol，2006，176(12):7686 －7694.

［7］Bartlett NW，Buttigieg K，Kotenko SV，et al.Murine interferon lambdas(typeⅢinterferons)exhibit potent antiviral activity in vivo in a poxvirus infection model［J］.Gen Virol，2005，86(6):1589 －1596.