转染CTGF基因对乳腺癌细胞MMP-2及TIMP-2表达的影响

许斌，陈寅，戴桂红，蒋小芹，王薇，赵国军，于鸿

(泰州市人民医院1.普外科，2.病理科，江苏 泰州225000)

结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)是新发现的CCN家族成员，在人类多种组织器官中广泛表达，具有促进细胞增殖、介导细胞黏附、刺激细胞迁移、促进血管生成等生物学功能［1］。近年来的研究显示CTGF的表达水平与多种恶性肿瘤的发生进展、浸润转移、肿瘤血管生成及预后密切关联［2］。CTGF基因在恶性肿瘤中的作用已引起了越来越多研究者的重视，但目前对CTGF基因在乳腺癌发生、发展过程中的具体机制并不十分明了。本实验采用细胞转基因技术，将CTGF cDNA经脂质体介导转染人乳腺癌MCF-7细胞株，观察转基因细胞克隆基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制因子-2(tissue inhibitor of metalloproteinase-2，TIMP-2)的表达及该克隆细胞增殖的改变，以进一步探讨CTGF对乳腺癌的作用机制，为今后对乳腺癌患者实施针对性基因治疗提供理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人乳腺癌MCF-7细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所;DMEM、胎牛血清及无血清培养液购于Gibco BRL公司;OneStep RT-PCR Kit购于Qiagen公司;Trizol试剂及Lipofectamine 2000转染试剂盒购于Sigma公司;鼠抗人MMP-2单克隆抗体及鼠抗人TIMP-2单克隆抗体购于 Dako公司;羊抗人CTGF多克隆抗体及兔抗羊FITC-IgG购于Santa Cruz公司;ABC试剂盒购于Vector公司。PCR引物由上海英骏生物技术有限公司合成。

1.2 脂质体介导瞬时转染CTGF基因

pcDNA3.0-CTGF真核表达质粒由台北大学Min-liang Kuo博士馈赠，经本实验室常规方法酶切鉴定［3］，送测序(联合基因公司)后扩增。人乳腺癌MCF-7细胞株培养按本实验室常规方法进行［4］。转染前1 d，MCF-7细胞以2×106个/孔传至6 cm培养皿内;12 h后，弃完全培养液，分别加入含有Lipofectamine 2000和CTGF真核表达质粒或脂质体和空载体pcDNA3.1混合物的无血清培养液4 ml;6 h后弃无血清培养液，改用10%胎牛血清完全培养液。

1.3 免疫荧光法检测CTGF蛋白的表达

转染结束后，冷丙酮固定细胞15 min，一抗为羊抗人多克隆抗体(1∶100)，二抗为兔抗羊FITC-IgG(1∶50)。荧光显微镜下观察细胞内荧光分布，并拍照记录。

1.4 RT-PCR法检测MCF-7细胞CTGF mRNA

转染MCF-7细胞，Trizol抽提总RNA，按照Qiagen公司试剂盒说明书提供的步骤在PCR仪上进行扩增反应。反应条件:50℃逆转录30 min，95℃灭活逆转录酶15 min，94℃变性2 min，60℃复性1 min，72℃延伸1 min，共33个循环。RT-PCR引物如下:内参照GAPDH上游5'-ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC-3';下游 5'-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'，预计扩增片段长度为450 bp。CTGF上游5'-TGTGGAATGGGCATCTCC-3';下游5'-TTTCATGATCTCGCCATCG-3'，预计扩增片段长度为306 bp。MMP-2上游 5'-CTCAGCGGCTCATGGTCCGGCC-3';下游5'-CATGGTCCGGCCCCCGCCCCCA-3'，预计扩增片段长度为278 bp。TIMP-2上游5'-CTGTCCCCTCBCCTCTTCGC-3';下游5'-TCCACCTCCTTCTCGCTCACTG-3'，预计扩增片段长度为303 bp。

1.5 蛋白质印迹法检测MMP-2和TIMP-2的表达

转染MCF-7细胞，常规抽提总蛋白，依标准方法进行10%SDS-PAGE变性电泳，半干式电转移至PVDF膜。一抗分别为羊抗人CTGF多克隆抗体(1∶200)，鼠抗人MMP-2单克隆抗体(1∶200)，鼠抗人TIMP-2单克隆抗体(1∶200)。二抗分别为生物素化兔抗羊IgG及生物素化兔抗鼠IgG(1∶400，上海长岛公司)。

1.6 定量和统计分析

凝胶电泳用Kodak凝胶成像仪进行拍照记录，Kodak图像分析软件测定条带光密度值。应用SPSS 13.0软件包对数据进行标准差(±s)计算和t检验。

2 结果

2.1 真核表达质粒pcDNA3.0-CTGF的鉴定

重组真核表达质粒pcDNA3.0-CTGF，测序结果显示，与基因库人CTGF序列 (GI∶325910844)完全一致。又经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切鉴定，结果显示重组质粒构建正确无误(图1)。

图1 重组质粒pcDNA3.0-CTGF的鉴定Fig 1 Confirming of recombinant plasmid pcDNA3.0-CTGF

2.2 转染CTGF基因的MCF-7细胞免疫荧光法检查

与 MCF-7及转空载体的 MCF-7相比，转染pcDNA3.0-CTGF的MCF-7，其胞质荧光亮度明显增强(图2)。

2.3 RT-PCR和蛋白质印迹法对转基因MCF-7的鉴定

图2 免疫荧光检测CTGF蛋白表达(FITC标记×200)Fig2 Immunofluorescence for detecting CTGF protein

RT-PCR结果表明，与空载体MCF-7细胞相比，转染CTGF的MCF-7细胞CTGF mRNA表达水平明显升高(t=8.264，P ＜0.01)(图 3);蛋白质印迹结果表明，转CTGF的MCF-7细胞CTGF蛋白表达水平也明显升高(t=9.387，P ＜0.01)，显示相对分子质量为38 000蛋白条带(图4)。该结果表明，经脂质体介导的上述基因转染是成功的。详见表1。

图3 RT-PCR法检测转染细胞CTGF mRNA的表达Fig 3 RT-PCR analysis for detecting CTGF mRNA

图4 蛋白质印迹法检测CTGF蛋白表达Fig 4 Western blot analysis for detecting CTGF protein

表1 各组细胞CTGF mRNA和蛋白表达的变化¯x ± s，n=5Tab1 The expressions of CTGF mRNA and protein in different groups

2.4 转基因MCF-7 MMP-2和TIMP-2蛋白的表达

蛋白质印迹结果显示，与转染空载体MCF-7相比，转染CTGF的MCF-7细胞MMP-2蛋白表达显著增加(t=13.145，P ＜0.01)，显示相对分子质量为92 000蛋白条带(图5);MCF-7与转染空载体MCF-7之间，差异无统计学意义(t=2.248，P ＞0.05)。与转染空载体 MCF-7相比，转染 CTGF的MCF-7 TIMP-2蛋白表达显著降低(t=11.852，P ＜0.01)，显示相对分子质量为21 000蛋白条带(图6);MCF-7与转染空载体MCF-7之间，差异无统计学意义(t=3.196，P ＞0.05)。详见表2。

图5 蛋白质印迹法检测MMP-2蛋白表达Fig 5 Western blot analysis for detecting MMP-2 protein

图6 蛋白质印迹法检测TIMP-2蛋白表达Fig 6 Western blot analysis for detecting TIMP-2 protein

3 讨论

深入阐明乳腺癌侵袭和转移的分子机制，对于寻找新的干预靶点，为乳腺癌的治疗提供新的线索具有重要意义。自从结缔组织生长因子于脐周静脉内皮细胞中首次发现后，其逐步成为器官纤维化领域的研究热点之一，但越来越多的研究显示，CTGF在肿瘤的形成与发展过程起着重要的作用，因此有望成为乳腺癌基因治疗的有效靶点之一。Bennewith等［5］报道，CTGF的高表达与胰腺癌、食管癌、胶质瘤、乳腺癌、胃癌、宫颈癌等患者的预后差密切相关，其机制可能为肿瘤细胞自身产生的CTGF可促进该肿瘤细胞的生长。Chen等［6］发现，CTGF通过整合素-细胞外信号调节蛋白激酶(Integrin-ERK)信号通路促进乳腺癌细胞侵袭、转移。Aikawa等［7］报道，乳腺癌中CTGF mRNA表达水平增高，可显著增强癌肿侵袭与转移能力，并显著缩短患者生存时间。这些研究结果提示，CTGF在乳腺癌的进展过程中起着重要的作用，CTGF在乳腺癌组织中的高表达提示乳腺癌患者预后差。

表2 各组细胞MMP-2及TIMP-2蛋白表达的变化¯x ± s，n=5Tab 2 The expressions of MMP-2 and TIMP-2 protein in different groups

大量研究证实，细胞外基质(extracellular matrix，ECM)和基底膜的降解和破坏是肿瘤侵袭、转移过程中的重要环节，而这些组织结构的破坏和降解需要相应的基质溶解酶参与。基质溶解酶系统由一个庞大的蛋白溶解酶家族组成，也称基质金属蛋白酶系统，包括MMPs及相应抑制剂TIMPs。MMP-2作为基质金属蛋白酶系统重要成员之一，通过降解和破坏ECM中的Ⅳ型胶原和明胶，利于肿瘤内血管的形成与生长，与多种恶性肿瘤的侵袭和转移关系极为密切［7］。TIMP-2是MMP-2组织抑制因子，能抑制MMP-2活性，MMP-2/TIMP-2表达失衡将促进肿瘤的侵袭和转移，并且TIMP-2表达增加往往与肿瘤侵袭能力下降及患者的预后较好相关［8］。本实验为探讨CTGF在乳腺癌侵袭和转移中的作用机制，采用细胞转基因技术，获得稳定高表达CTGF的乳腺癌细胞克隆，与对照组相比，该细胞克隆MMP-2表达增加，而TIMP-2表达降低，提示CTGF参与MCF-7细胞MMP-2及TIMP-2的合成代谢过程，并通过上调MMP-2的表达及下调TIMP-2的表达而促进乳腺癌侵袭与转移。然而，对于CTGF参与促进恶性肿瘤的生长、侵袭及转移的作用机制还远未阐明。近年来，一些研究发现除TGF-β/Smad信号通路可调节 CTGF的表达，丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、ERK和C-Jun N末端激酶(JNK)与CTGF信号通路之间存在相互作用或相互串话(crosstalk)［9］。Kwon 等［10］报道，ras/MAP-ERK 信号通路依赖Smad4而显著上调乳腺癌细胞CTGF的表达。这些实验结果提示我们，在今后进一步研究乳腺癌发生机制以及CTGF所起作用时，还必须加强CTGF信号通路与其他信号通路之间的相互关系的实验研究，才能从本质上阐明其发生机制，从而有可能探索出更具有针对性和有效性的治疗策略和方法。

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［4］许斌，肖蔚，焦霞，等.生存素反义寡核苷酸对乳腺癌MCF-7细胞株MMP-2及MMP-9表达的影响［J］.江苏大学学报:医学版，2011，21(3):203 －207.

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