应用液液萃取分析中度烘烤橡木片中挥发性化合物*

周双，徐岩，范文来，李记明，于英，姜文广，李兰晓

1(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学酿酒科学与酶技术研究中心，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡，214122)2(张裕集团公司技术中心，山东烟台，264000)

陈酿是葡萄酒发酵结束后的重要工艺。陈酿过程中，葡萄酒在香气、颜色、口感等方面上发生重要变化。主要原因是橡木桶中一些重要化合物转移到葡萄酒中，如橡木中的酚醛类和挥发性酚类等赋予葡萄酒特有的特征风味，增强其风味复杂性［1］。另外，它们对于葡萄酒香气和风味的贡献已有相关文献报道［2］:顺、反式威士忌内酯(木味、椰子味)，糠醛(干果味)及其衍生物，酚醛类化合物如丁香醛、香兰素(香草味)，挥发性酚类化合物如丁香酚(烟熏味)、愈创木酚、4-甲基愈创木酚等［3］。

橡木风味主要表现于挥发性成分的种类与组成，橡木挥发性成分测定的预处理包括液液萃取(LLE)［4］、顶空固相微萃取(HS-SPME)［5］、加速溶剂萃取(ASE)［6］、减压蒸馏［7］、同时蒸馏萃取(SDE)［8］等。液液萃取是最传统的方法，无需复杂仪器设备，处理样品量大，回收率较高;可以实现大量样品的浓缩，有利于极微量化合物的发现。2009年，Simoón等人［4］利用液液萃取与GC-MS联用在法国、美国和西班牙的橡木中检测到110种挥发性化合物。

目前，我国葡萄酒生产主要采用法国与美国进口橡木，随着我国葡萄酒产量逐年增长，以及国际竞争加剧，研究与开发国产橡木势在必行。为加速橡木国产化进程，分析我国橡木存在的优势与不足，本研究采用液液萃取方法研究我国橡木的挥发性成分，进行定性、定量分析，并与欧美橡木进行差异比较。

1 材料与方法

1.1 样品和试剂

橡木样品:由张裕公司提供，3个样品分别是法国、美国与中国的中度烘烤橡木片，各1批次。

试剂:无水乙醇(上海安谱科学仪器有限公司，色谱纯)，无水二氯甲烷、NaCl、无水Na2SO4(上海国药集团，分析纯)，鉴定中标明有保留指数(RI)的化合物(Sigma-Aldrich公司，色谱纯)。

1.2 主要仪器

气相色谱-质谱联用仪 Agilent GC 6890－5975 mass selective detector(MSD)、气相色谱 Agilent GC(美国安捷伦公司);DC－12氮气吹扫仪(上海安谱科学仪器有限公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 挥发性化合物的提取

橡木片中挥发性化合物的提取参照Chatonnet等人［9］的实验方法。将2 g橡木片样品浸泡在100 mL酒精水溶液中(12%乙醇，0.7 g/L酒石酸，1.11 g/L酒石酸氢钾)。在室温、黑暗条件下浸提15 d，每天定时摇瓶1次。过滤，滤液中添加内标和无水NaCl饱和，用45 mL二氯甲烷液液萃取3次，每次15 mL。合并有机相，用无水硫酸钠干燥过夜，氮吹，浓缩至250 μL，GC-MS 分析。

1.3.2 GC-MS分析

色谱条件:FFAP极性柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)分离挥发性化合物。气相色谱进样口和检测器温度都为250℃，载气为氦气，流速为2 mL/min;进样量为1 μL，不分流进样;升温程序为:初温50℃，保持 2 min，以 6℃/min升至 230℃，230℃保持 10 min。

质谱条件:EI电离源，电子轰击能量为70 eV，离子源温度为230℃;扫描范围为35～350 amu。

1.3.3 化合物鉴定

挥发性化合物的定性通过质谱库检索与标准品的保留指数(RI)比对鉴定，没有标准品的化合物通过与NIST 05质谱库(Agilent Technologies Inc.)中标准谱图以及文献中报道的保留指数RIL进行比对鉴定。

1.3.4 化合物定量

采用选择离子(SIM)方法定量，以2-辛醇(终浓0.58 mg/L)、γ-己内酯(终浓度 2.11 mg/L)、邻香兰素(终浓 1.37 mg/L)、3，4-二甲基苯酚(终浓 0.02 mg/L)为内标进行定量分析。没有标准品的组分半定量。

2 结果与讨论

2.1 橡木片中挥发性化合物鉴定

橡木片酒精浸提液GC-MS分析检测到85种化合物，包括2种萜烯醇类、1种醛类、7种有机酸类、2种酯类、3种内酯类、7种芳香族类、6种酮类、15种呋喃类、34种酚类，以及8种其他化合物。与国内研究文献［7］相比，发现了更多的酚酮类化合物，如香草乙酮、4-羟基-3-甲氧基苯丙酮等10种酚酮类化合物;另外，新检测到4种呋喃酮类化合物，包括3-甲基-2(5H)-呋喃酮、5-乙氧基二氢-2(3H)-呋喃酮、2(5H)-呋喃酮和5-乙酰基二氢-2(3H)-呋喃酮。发现了更多的痕量化合物，如2-羟基-3-甲基-2-环戊烯酮、高香茅醇、茴香醛、乙酰氧基-2-丁酮等各类挥发性化合物。

2.2 呋喃类化合物

呋喃类化合物是橡木中一类重要的化合物，共检测到15种，包括糠醛及其衍生物、2-糠醛缩二乙醇、2，5-二甲酰基呋喃、糠醇、糠酸、糠酸乙酯等，以及在国产橡木中首次检测到的4种呋喃酮化合物，如2(5H)-呋喃酮等，其质量浓度在几μg/g到几百μg/g之间。呋喃类化合物在橡木中的总质量浓度最高的是法国橡木(811.40 μg/g)，中度烘烤的法国橡木中糠醛达430.62 μg/g，另外，质量浓度高的还有5-甲基糠醛与5-羟甲基糠醛，其中糠醛和5-甲基糠醛在葡萄酒中的感官阈值分别是20 mg/L和45 mg/L［10］，估计在葡萄酒中风味贡献有限。糠醛由半纤维素的主要成分戊糖产生，而5-羟甲基呋喃和5-甲基呋喃主要是由纤维素的己糖产生［4］。2-糠醛缩二乙醇曾经在国产东北烘烤橡木片中检测到［8］，该化合物是在浸泡液的酸性条件下，由糠醛与乙醇发生缩醛反应而产生［11］。

表1 橡木提取液中挥发性化合物的检测(μg/g橡木)

续表1

续表1

2.3 挥发性酚类化合物

在橡木中，共检测到34种挥发性酚类化合物，是橡木中种类最多、最重要的挥发性化合物，中度烘烤的中国橡木中酚类化合物具有最高的总质量浓度(1 125.5μg/g)，其中香兰素质量浓度达到455.04 μg/g，包括羟基酚类、单甲氧基苯酚类、双甲氧基苯酚类以及三甲氧基苯酚类共四类酚类化合物，它们的结构式如图1所示。

图1 四类挥发性酚类化合物的结构式

羟基酚类化合物主要是苯酚及其衍生物，极其微量。

单甲氧基苯酚类化合物主要包括愈创木酚及其衍生物，丁香酚及其异构体，以及赋予橡木特有香草风味的香兰素;其中愈创木酚和4-甲基愈创木酚具有烟熏香气，与其烘烤香气有一定相关性［12］。异丁香酚可以赋予葡萄酒橡木特征［13］。另外，4-乙基愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚的感官阈值分别是140 μg/L、380 μg/L［10］，橡木提取液中的质量浓度远低于其感官阈值。双甲氧基苯酚类包括2，6-二甲氧基苯酚及其衍生物，以及丁香醛、松柏醛与芥子醛。2，6-二甲氧基苯酚是具有烟熏香［3］。三甲氧基苯酚类只检测到3，4，5-三甲氧基苯酚，该化合物是一种重要的医药中间体［14］。

10种酚酮类化合物首次在国产橡木中检测到，如香草乙酮、4-羟基-3-甲氧基苯丙酮、1-(4-羟基-3，5-二甲氧基苯基)-2-丙酮等，它们的质量浓度较高，都含有愈创木基、紫丁香基等木质素单体结构，是木质素降解物，与木质素在风干和烘烤过程中的降解密不可分［15］。这类化合物对于橡木风味的影响，鲜有报道，但其质量浓度较高，对于风味贡献有待研究。

此外，挥发性酚类化合物中的香兰素和丁香醛是橡木中重要的化合物［7］，其质量浓度较高，在中国中度烘烤的橡木中分别达到455.04 μg/g和300.26 μg/g，换算它们在橡木提取液中的质量浓度分别为9100.8 μg/L 和 6005.2 μg/L，而葡萄酒中的感官阈值分别为 320 μg/L 和 50 000 μg/L［10］;前者香气活性值(OAV)为28，表现出强烈的香草香;后者OAV小于1。橡木中木质素的降解主要是由于烘烤过程中的高温(高于120℃)导致的［16］。

2.4 内酯类化合物

在橡木中检测到3种内酯类化合物，γ-丁内酯、顺、反式威士忌内酯，结构式如图2所示。

图2 两种威士忌内酯异构体的结构式

威士忌内酯是橡木中的重要香气物质，具有椰子香气和新鲜木头的气味［1］。威士忌内酯有两种异构体，在葡萄酒中的感官阈值分别是顺式威士忌内酯为67 μg/L、反式威士忌内酯为 790 μg/L［17］。Wilkinson等人研究了由前体3-甲基-4-羟基辛酸产生β-甲基-γ-辛内酯的反应过程［18］。而另一观点认为威士忌内酯是由木头中脂类化合物的热降解而产生;并随着烘烤的进行，降解反应同时发生［19］。

2.5 其他常见化合物

橡木中检测到7种挥发性有机酸，总质量浓度在美国橡木中达到最高(300.61 μg/g)，包括乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、辛酸、棕榈酸，其中以乙酸、丙酸质量浓度较高。

7种芳香族化合物分别是苯甲醛、苯乙酮、2-羟基苯甲醛、苯甲醇、苯乙醇、茴香醛、苯甲酸，它们是具有芳香特性的化合物，但在橡木中极其微量，低于其嗅觉阈值，而不能在橡木提取液中呈现其风味特征。

橡木中的酮类化合物种类较少，质量浓度较低，如 3-羟基-2-丁酮、1-羟基-2-丁酮、2-辛酮、2-壬酮、1-乙酰氧基-2-丙酮、1-乙酰氧基-2-丁酮，其中1-乙酰氧基-2-丙酮相对于其余酮类化合物具有较高的质量浓度(57.25 μg/g)，对橡木风味的贡献有待验证。

其他化合物还包括2种萜烯醇类、1种醛类、2种环酮类、2种酯类、1种吡咯类、1种吡喃类，以及4种未知化合物。其中高香茅醇、3-氧代-α-紫罗兰醇极其微量;己醛对于橡木香气是不协调的异味化合物［15］。检测到的2种环酮类微量成分3-乙基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮和 2-羟基-3-甲基-2-环戊烯酮是橡木烘烤后形成的，具有烘烤香、焦香，是橡木烘烤的特征香［20］。另外，还有己酸乙酯、棕榈酸乙酯，2-吡咯甲醛和麦芽酚。在未鉴定的4种化合物中，峰56、60、63都含有特征离子m/z=43。

2.3 不同产地橡木比较

对法国、美国与中国橡木进行初步比较，可以发现:首先，不同产地橡木中的顺、反式威士忌内酯之比不同。法国橡木为0.89，美国橡木7.68，中国橡木8.58。通常认为法国橡木顺式与反式威士忌内酯之比小于2，美国橡木的比例大于5。从目前结果可以看出，中国橡木与美国橡木更为接近，比法国橡木含有更多的顺式威士忌内酯［21］。

从呋喃类化合物质量浓度比较也得出同上的结论，即中国橡木更类似于美国橡木。法国橡木呋喃类化合物质量浓度(811.40 μg/g)比中国橡木(475.66 μg/g)和美国橡木(423.39 μg/g)高，而中国橡木与美国橡木相似;其中中度烘烤的法国橡木中糠醛的质量浓度高达 430.62 μg/g，而美国橡木中只含有171.09 μg/g，中国橡木为 268.26 μg/g，法国橡木中糠醛质量浓度是美国橡木的2.52倍，中国橡木的1.61倍。

香兰素、丁香醛两种重要的风味化合物在三种橡木中具有较大的差异。中国中度烘烤的橡木质量浓度达455.04 μg/g，是法国、美国橡木的3～4倍，赋予中国橡木提取液特有的香草气味。中度烘烤的美国和法国橡木中的香兰素质量浓度相差仅为17.59 μg/g，比较接近，这与橡木组成和烘烤过程是密切联系的。相比较而言，中国橡木与欧美橡木各有特色。

3 结论

采用液液萃取与气相色谱-质谱联用技术研究分析橡木中的挥发性成分，具有无需复杂设备，萃取溶剂便宜，处理样品量大，大幅度浓缩样品，发现更多微量化合物等优点，是一种适合橡木样品前处理的方法。在橡木中共检测到85种化合物，包括2种萜烯醇类、1种醛类、7种有机酸类、2种酯类、3种内酯类、7种芳香族类、6种酮类、15种呋喃类、34种酚类，以及8种其他化合物。如香兰素、丁香醛、糠醛、2-糠醛缩二乙醇、5-甲基糠醛、愈创木酚、4-甲基愈创木酚、顺、反式威士忌内酯、乙酸等重要的风味化合物。从呋喃类、橡木内酯、香兰素和丁香醛等化合物比较看，中国橡木与美国橡木更加类似。

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