三七中高产人参皂苷Rd真菌的鉴定*

王艳，代永东，葛锋，虞泓，赵方允

1(昆明理工大学生命科学与技术学院，云南昆明，650500)2(云南大学中草药生物资源研究所云百草实验室，云南昆明，650091)3(昆明市延安医院，云南昆明，650224)

三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen为五加科人参属植物，主产于云南，主要活性成分为三七总皂苷(Panax notoginseng saponins，PNS)［1］。目前为止，已从三七中分离出70余种人参皂苷，均属达玛烷型四环三萜皂苷［2］。其中人参皂苷Rd的含量较少，西洋参含 0.1%～0.2%，人参含 0.2%～0.3%，三七含0.5%～0.7%［3］。Rd对心脑血管、神经系统、免疫系统等作用独特。目前，人参皂苷Rd已完成Ⅱ期临床试验，正在开展Ⅲ期临床研究，有可能成为治疗脑中风的新型临床治疗药物，同时，在镇痛、神经保护作用方面，人参皂苷Rd有比其他单体皂苷更强的活性［4］。人参皂苷Rd在植物中含量少，化学结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前仅能从原植物的根、茎、叶中提取，效率低，成本高，严重制约了人参皂苷Rd的开发利用［5］。本研究组从云南文山三七根茎上分离得到能够高产人参皂苷Rd的真菌，经过形态鉴定及ITS分析，鉴定为长枝木霉Trichoderma longibrachiatum Rifai，关于长枝木霉转化人参皂苷为本文首次报道。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

菌株WYA2012和WYAC2012均从云南文山的三七根茎分离纯化获得，保存于云南大学生命科学学院云百草实验室。

1.1.2 试剂

三七皂苷R1、人参皂苷Re和人参皂苷Rb1，购于中国药品生物制品检定所;人参皂苷Rg1、人参皂苷Rg3、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、原人参三醇PPT、人参皂苷F1、人参皂苷F2和人参皂苷C－K，购于南方标准物质网;乙腈、甲醇均为色谱纯;Taq酶(配套 25mmol/L MgCl2，10 ×Buffer)、dNTP Mixture(ATP、TTP、CTP、GTP)均为上海生工分装，其余试剂均为市售分析纯。

1.1.3 仪器

高效液相色谱仪(戴安ULTIMATE 3000 LPG－3400A四元梯度泵，WPS-3000SL自动进样器，PDA-3000二极管阵列检测器，TCC-3000柱温箱，美国戴安仪器公司)，Waters Symmetry C18色谱柱(250×4.6 μm，5 μm，100A)，美国 Waters公司;Kodak Image Station 440CF凝胶成像系统，日本Kodak公司;PE9700扩增仪，美国PE公司;Dyy-Ⅲ－33A型垂直电泳仪，北京六一仪器厂。

1.1.4 培养基

(1)分离、纯化、活化培养基(PPDA):洋芋粉20 g/L，蔗糖2 g/L，琼脂18 g/L，蛋白胨5～20 g/L，自然pH，121℃灭菌 30 min。

(2)三七培养基:精确称取1 g过60目筛的三七粉于100 mL三角瓶，加入0.2 mL无机盐(10%KH2PO4，5%MgSO4)，20 mL 水，自然pH，121℃灭菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的筛选

将三七根茎粉碎加入到装有无菌水和玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀，在不同稀释倍数，采用稀释涂布平板法和平板划线分离法，涂布到含有抗生素(链霉素30 μg/mL)的PPDA平板上，于23℃恒温培养，至长出菌落。挑取不同形态的菌丝分别接种于PPDA平板上纯化，挑取单菌落转接于斜面PPDA备用。

将菌种接种于三七培养基，发酵4d后，抽滤，用10 mL纯水清洗滤渣，合并滤液，离心(4 000 r/min)30 min，取上清液加入等体积水饱和正丁醇超声萃取1 h，静置分层后，收集上层正丁醇相旋蒸(60℃)至干燥，用5 mL 70%甲醇溶解残渣，进行HPLC检测。

1.2.2 菌种的形态鉴定

1.2.2.1 菌落形态观察

将供试菌株接种于PPDA和查氏培养基上，23℃培养，每隔1 d观察1次，记录菌落形态特征和培养性状。

湿室载片培养:将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上载玻片，置于用无菌水保湿的平皿内培养一定时间，以便菌体在载玻片和盖玻片之间沿载玻片横向生长。

1.2.2.2 产孢结构观察

观察湿室载片上自然生长的菌体状态。

1.2.3 菌株的ITS序列分析

(1)基因组DNA的提取:菌株基因组DNA的提取采用 CTAB 法［6］。

(2)ITS序列PCR扩增及测序:ITS序列引物［7］为 ITS4:5’-GGAAGTAAAAGT-CGTAACAAGG-3’，ITS5:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。扩增的反应体系(50 μL):灭菌去离子水 33 μL、10 × Buffer(含 2 mmol/L Mg2+)5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxid，DMSO)2.5 μL、10 μmol/L ITS4 和 ITS5 各2 μL、5U Taq 酶 0.5 μL、模板1 μL。扩增程序为:95℃ 4 min;94℃ 45 s，53℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循环30 次，72 ℃ 8 min，12 ℃保存。琼脂糖电泳检测，选取条带清晰并无杂带的扩增样品送华大基因直接测序。

(3)ITS测序数据处理。序列拼接及BLAST搜索:根据测序数据，利用Bioedit检测ABI文件中峰行图的优劣，用Lasergene7.1中的SeqMan进行序列拼接，得到完整的 ITS序列。将上述序列在线 Blast(URL:http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，发现目标序列与 T.longibrachiatum、T.konilangbra Samuels、Pardo-Schulth/Hypocrea stromatica Bezerra，Costa、Bastos等物种(属于Trichoderma Sect.Longibrachiatum)相似性较高。选择并下载若干T.Sect.Longibrachiatum物种ITS序列，并包含必要的正模标本序列数据，使用Clustalx 2.0［8］将以上ITS序列进行多序列比对，然后用MEGA 5.05中Analysis对ITS进行分区，统计ITS1、ITS2和5.8S区的长度和碱基总数和变异情况。利用ModleTest 3.7［9］寻找最适碱基替换模型，并选择最大似然法Maximum Likelihood Tree(ML)［10］，Bootstrap 设为 1 000，以 T.stromaticum Samuels、Pardo-Schulth/Hypocrea stromatica Bezerra，Costa、Bastos为外类群构建系统聚类树。

2 结果与分析

2.1 活性菌株的筛选

通过对三七块茎内生真菌的分离与纯化，共得到16株真菌，分别发酵三七培养基后，经HPLC检测，得到2株能够高产人参皂苷Rd的菌株，分别编号为WYA2012和WYC2012，其中WYA2012转化三七的HPLC色谱图见图1。

图1 标准品(A)，原药材(B)，WYC2012转化三七(C)的HPLC色谱图

菌株WYA2012和WYC2012的HPLC检测结果如表1，经过真菌转化可以明显看出Rd由原药材的5.33 mg/g，分别增加至 14.17、15.40 mg/g，增加了 2倍，与此同时，小极性皂苷 Rh1、F1、F2、Rg3、PPT 和 CK都各有增加;相反，三七中主要的皂苷R1、Rg1、Re、Rb1显著下降，Rb1由原药材的18.77 mg/g分别降至0.42和0.45 mg/g，说明实验所用真菌能够转化三七中量多的大极性皂苷为小极性皂苷，且高产Rd。

表1 株菌发酵三七的皂苷含量变化

2.2 菌株形态及显微结构鉴定

2.2.1 平板观察

菌株WYA2012形态特征见图2。在PPDA平板上培养1d，菌落生长缓慢，菌落短绒状，中部致密、隆起、呈“脓泡”状结构、雪白;3d后菌落迅速生长，且不规则，绒状隆起的产孢簇平展或疏松成簇，产生青绿色的分生孢子堆，孢子堆密集，呈绒状小团，多集中于菌落中间，菌落边缘出现散生的白色菌丝，菌落在培养基背面呈黄色。查氏平板上的培养性状:性状与PPDA的基本一致，不同的是培养基背面不变色(未产生色素)，菌丝生长量明显较PPDA少很多。菌株WYC2012形态特征与菌株WYA2012大体一致，但菌落上产生的分生孢子堆是墨绿色，且孢子发散(见图2)。

2.2.2 显微观察

显微镜下可见2株菌的初级分生孢子梗长而直，以众多小丛束分布于菌落表面，次级分支较短，呈直角伸出或朝主枝弯曲，少见再分枝。瓶梗不规则排列，多数单生，偶尔2或3个轮状排列，基部略变细，圆柱状，顶部明显变细，瓶梗长(4.8)5.6～10.8 μ m，宽(1.9)2.5～4.5 μ m;分生孢子光滑，倒卵形或椭圆形，大小为(2.8)3.0～4.5 μ m×(1.4)1.8～2.6 μm，浅绿色。湿室载片观察见图3。

根据文成敬［11］、章初龙［12］、王斌［13］等人对木霉的分类研究，初步鉴定这2株真菌为木霉Trichoderma。

图2 菌株WYA2012与WYC2012平板形态特征

图3 株菌产孢结构及分生孢子(×100)

2.3 ITS序列分析及聚类树构建

在所研究的22条序列中，有2条序列为T.stromaticum，其余的均属于 T.Sect.Longibrachiatum，经过多序列比对，碱基统计，实验所选取的22条序列的ITS序列总长度为546～551bp，分离得到的2菌株ITS序列总长度为550bp，碱基总含量在57.80%～58.26%，总变异位点数为23个，其中ITS1区总长度217～224bp，GC含量为57.73%～59.36%，其中转换颠换位点6个，插入缺失位点8个;5.8S长度为160bp，GC含量为46.88%，无一变异位点;ITS2长度165～172bp，GC含量为68.02%～69.09%，其中转换颠换位点 2个，插入缺失位点 7个。发现 JC(Jukes-Cantor)+G(Gamma distribution)为最适模型，其BIC(Bayesian Information Criterion)分值最低。利用MEGA5.05软件使用JC+G模型构建ML聚类树，结果见图4。

从图4可以看出，2株木霉菌株与T.longibrachiatum聚为紧密一支，而其他种与其显著分开。另外，从ITS序列本身来看，发现实验的2株材料与本研究所选的来自GenBank中4株长枝木霉仅在全ITS中有一个位点的变异，即第134位点上发生缺失(或插入)变异。从而显著支持实验材料即为长枝木霉。

综合形态和显微结构及ITS序列分析，实验所用高产Rd的菌株为长枝木霉T.longibrachiatum。

图4 木霉菌株(WYC2012、WYA2012)及相关木霉菌物种菌株的ML聚类树

3 讨论

近几年，国内外用于转化Rd的菌株有灰绿犁头霉 Absidia glauca Hagem，专一转化 Rb1 为 Rd［14］;镰刀菌Fusarium sacchari(E.J.Butler＆Hafiz Khan)W.Gams可将Rb1转化为Rd，再转化为F2，进一步转化为C-K，也可将Rc转化为Fe或Mc，进一步转化为 C-K［15］;黄枝孢霉 Cladosporium fulrum Cooke 可将Rb1 专一转化为 Rd［16］;腐霉菌 Pythium irregular Buisman可将Rb1转化为Rd或绞股蓝皂苷XVII，进一步转化为 F2［17］;拟青霉 Paecilomyces bainier sp.229可将Rb1大量转化为Rd，接着转化为F2或Rg3，F2进一步转化为C-K，而Rg3转化为 Rh2［18］。本研究菌株为长枝木霉T.longibrachiatum，对人参皂苷具有转化能力。

目前，木霉菌是生防益菌中的明星菌。早期对木霉菌的研究主要集中在植物病原菌的防治方面［19］，近期的研究重点则是从中发现具有更广泛活性的化合物［20］，诸如聚酮类(Polyketides)、氨基酸及其衍生物(amino acid and derivatives)、萜烯类(terpenes)等。此外，还有研究表明，木霉菌对植物有促生作用［21］。长枝木霉作为三七根茎上的真菌，可能与三七存在互利共生的关系，或具有拮抗多种病原真菌的作用，是具有潜力的资源微生物。根据国内外研究，高产Rd的转化机理可能与产生的葡聚糖酶或纤维素酶相关，水解人参皂苷糖基得到Rd［22］。本研究是以三七原药材作为转化底物，经长枝木霉发酵转化后，人参皂苷Rd含量明显增加，为有效利用开发三七生药功效成分提供了新思路。但因为转化机理复杂，所以不能明确转化途径，有待于深入研究。

一直以来，木霉菌因其形态特征易受培养条件及生长环境的影响，具有明显的生态多样性和物种多样性;加之鉴定过程中稳定形态性状少，变异性大，仅靠形态分类，人为误差较大，准确度较差。ITS序列逐渐被应用于木霉菌的鉴定中［23－24］。木霉菌属被分为4个组，分别是Sect.Longibrachiatum、Sect.Trichoderma、Sect.Pachybasium 和 Sect.Hypocreanum，这 4 个组在ITS聚类树中各自聚类在不同分支上。本研究选择Sect.Longibrachiatum物种为标靶，以T.stromaticum为外类群(该种与Sect.Pachybasium的 T.inhamatum Veerkamp and Gams为姐妹支［25－26］)。聚类分析显示，本研究的2株菌株与长枝木霉T.longibrachiatum 菌 株(DAOM167674、DAOM231259、ATCC18648T、ATCC208859)在 Longibrachiatum 组内明显聚为一支，表现出极强的组内同质性。

根据上述2株菌株形态、菌落特征和产孢结构及其ITS分析，鉴定这2株菌株均为长枝木霉T.longibrachiatum。

［1］冯陆冰，潘西芬，孙泽玲.三七的药理作用研究进展［J］.中国药师，2008，11(10):584－ 589.

［2］Qi L W，Wang C Z，Yuan C S.Isolation and analysis of ginseng:advances and challenges［J］.Natural Product Reports，2011(3):467 －495.

［3］Shi S，Lian-Wen Q，Guang-Jian D，et al.Red notoginseng:higher ginsenoside content and stronger anticancer potential than Asian and American ginseng［J］.Food Chemistry，2011，125(4):1 299 －1 305.

［4］周超群，周珮.人参皂苷Rd的研究进展［J］.中草药，2009，5(40):832－836.

［5］张薇，孙晓东，张萍，等.专一转化人参二醇类皂苷Rb1为Rd的真菌菌株的筛选［J］.菌物学报，2011，30(2):305－311.

［6］Rogers S O，Bendich A J.Extraction of DNA from plant tissues.Plant Molecular Biology Manual［M］.Dordrecht:Kluwer Academic Publishers，1988，A6:1－10.

［7］White T J，Bruns T，Lee S，et al.Applification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics.In:Innis M A，Gelfand D，Sninsky J J，White T J(Eds).PCR Protocols:A Guide to Methods and Applification［M］.New York:Academic Press，1990:315－322

［8］Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al.Clustal W and Clustal X version 2.0［J］.Bioinformatics，2007，23(21):2 947－2 948.

［9］Posada D，Buckley T R.Model selection and model averaging in phylogenetics:advantages of the AIC and Bayesian approaches over likelihood ratio tests［J］.Systematic Biology，2004，53(5):793－808.

［10］Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using Maximum Likelihood，evolutionary distance，and Maximum Parsimony methods ［J］.Molecular Biology and Evolution，2011，28(10):2731－2739.

［11］文成敬，陶家凤，陈文瑞.中国西南地区木霉属分类研究［J］.真菌学报，1993，12(2):118－130.

［12］章初龙，徐同.我国河北、浙江、云南及西藏木霉种记述［J］.菌物学报，2005，24(2):184－192.

［13］王斌，Ali Khatib Baker，刘金亮，等.长枝木霉TICC鉴定及其生物学特性研究［J］.中国农学通报，2011，27(5):338－345.

［14］吕国忠，张薇，孙晓东.人参内生灰绿犁头霉菌及利用其制备人参皂苷 Rd的方法［P］.CN，2101010571874，2011－06－01.

［15］Han Y，Sun B，Jiang B，et al.Microbial transformation of ginsenosides Rb1，Rb3 and Rc by Fusarium sacchari［J］.Journal of Applied Microbiology.2010，109(3):792－798.

［16］Gao J，Zhao XS，Liu HB，et al.A highly selective ginsenoside Rb1-hydrolyzing β-D-glucosidase from Cladosporium fulvum［J］.Process Biochemistry，2010，45:897 －903.

［17］Neculai M A，Ivanov D，Bernads M A.Partial purification and characterization of three ginsenoside-metabolizing β-glucosidases from Pythium irregular［J］.Phytochemitry，2009，70(17/18):1 948－1 957.

［18］Yan Q，Zhou W，Shi XL，et al.Biotransformation pathways of ginsenoside Rb1 to compound K by β-glucosidases in fungus Paecilomyces bainier sp.229［J］.Process Biochemistry，2010，45(9):1 550－1 556.

［19］Howell C R.Mechanisms employed by Trichoderma species in the biological control of plant diseases:the history and evolution of current concepts［J］.Plant Disease，2003，87(1):4－10

［20］李纪顺，陈凯，杨合同，等.木霉抗生性代谢产物研究进展［J］.农药，2010，49(10):713－719.

［21］赵蕾，滕安娜.木霉对植物的促生及诱导抗性研究进展［J］.植物保护，2010，36(3):43－46.

［22］陈涛，徐燕.纤维素酶产酶菌株的选育与固态发酵［J］.食品研究与开发，2011，32(11):119－125.

［23］Yu ZF，Qiao M，Zhang Y，et al.Two new species of Trichoderma from Yunnan，China［J］.Antonie van Leeuwenhoek，2007，92(1):101－108.

［24］Hoyos-Carvajal L，Orduz S，Bissett J.Genetic and metabolic biodiversity of Trichoderma from Colombia and adjacent neotropic regions［J］.Fungal Genetics and Biology，2009，46(9):615－631.

［25］Kuthls K，Samuels GJ，Meyer W，et al.Revision of Trichoderma sect.Longibrachiatum including related teleomorphs based on analysis of ribosomal DNA internal transcribed spacer sequences［J］.Mycologia，1997，89(3):442－460

［26］Lee CF，Hseu TH.Genetic relatedness of Trichoderma sect.Pachybasium species based on molecular approaches［J］.Canadian Journal of Microbiology，2002，48(9):831－840.