重组降血压肽IYPR的分离与稳定性研究*

黄六容，王薇薇，马海乐，白慧敏，鞠英姿，雷雪香

(江苏大学食品与生物工程学院江苏省农产品物理加工重点实验室，江苏镇江，212013)

高血压是常见的心血管疾病，发病率高，常伴有心脏、血管、肺以及肾脏等器官功能性或器质性改变，是引发心、脑、肾和眼血管等各种并发症的一个重要危险因素［1］。目前市场上广泛使用的化学合成的抗高血压药物长期服用会对人的消化系统、心脑肾等器官造成危害，医务人员与患者更青睐于非化学合成药物疗法［2－3］。因此，在治疗高血压药物的研究中，降血压肽的研究已成为热点。

降血压肽是一种血管紧张素转移酶(Angiotensin I-Converting Enzyme，ACE)抑制剂，通过抑制血浆和血管内皮细胞ACE的活性，调节肾素-血管紧张素系统和激肽释放酶-激肽系统起到降血压的作用［4］。目前，降血压肽主要通过酶解法从天然蛋白中分离获得，由于分离纯化工艺复杂、产量低而难以产业化［5－7］。利用基因工程法制备降血压肽生产周期短，不受原料限制，分离纯化工艺简单，便于大规模生产，因此具有广阔的前景。

本试验在成功构建基因工程菌的基础上，研究了ACE抑制剂IYPR(Ile-Tyr-Pro-Arg)的分离纯化方法，并对其热稳定性、耐酸碱性和抗肠道酶解能力进行研究，以确定所制备的降血压肽活性是否稳定。

1 材料与方法

1.1 材料

Multiskan FC全波长酶标分析仪，美国热电公司;GA92-ⅡDB超声细胞破碎机，无锡上佳生物技术有限公司;LC-20高效液相色谱仪，日本岛津;Thermo LXQ液相色谱离子阱质谱联用仪，美国热电公司。

大肠杆菌BL21-MIR7，本实验室构建，具体构建方法过程参考文献［8］;透析袋，美国光谱医学公司;Sephadex G-15，台州市四甲生化塑料厂;His标签纯化树脂，Biomiga公司;呋喃基-丙烯酰-苯基-甘氨酰-甘氨酸(FAPGG)，Sigma公司;胃蛋白酶、胰蛋白酶，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌体的培养与获得

取重组大肠杆菌单菌落，用5 mL LB液体培养基(含50 μg/mL卡那霉素)于37℃摇床培养12 h，活化后的菌种按1%接种量接种于含有150 mL LB培养基(含50 μg/mL卡那霉素)的500 mL三角瓶中，37℃恒温摇床培养至 OD600为1.0时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.6 mmol/L，37℃诱导 7 h，5 000 r/min离心10 min，收集菌体，菌体用0.9%NaCl洗涤2次后于－20℃冰箱保存备用。

1.2.2 重组蛋白的提取与纯化

取湿重为1 g的菌体，反复冻融3次，加入破菌缓冲液 8 mL(50 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)，400 W 超声 40 次(每次超声时间和间隔时间均为2 s)，破碎液于4℃、10 000 r/min离心10 min，收集沉淀。沉淀加入3 mL包涵体洗涤液I(50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA，100 mmol/L NaCl，0.2%Triton X －100，pH 8.0)1次，再用3 mL包涵体洗涤液II(50 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L NaCl，pH 8.0)洗涤2 次，沉淀溶于2 mL包涵体溶解液(50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L尿素，300 mmol/L NaCl，pH 8.0)，4 ℃溶解 3 h，10 000 r/min离心10 min收集上清液。收集的上清液采用Ni2+-NTA His标签纯化树脂进行纯化，用含有1 mmol/L、20 mmol/L和200 mmol/L咪唑的包涵体溶解液洗去残留样品、杂蛋白和目的蛋白。

1.2.3 重组蛋白的肠激酶酶切与标签的去除

将亲和柱回收的目的蛋白，用透析袋(3 500 u)脱盐24 h，冻干后用含有2 mol/L尿素的Tris-Cl溶解，溶解液与1/10体积的10×肠激酶酶切缓冲液(500 mmol/L Tris-HCl，10 mmoL CaCl2，1%Tween-20，2 U/mL，pH 8.0)混合37℃反应24 h。酶切反应结束后，再用透析袋(500 u)脱盐24 h，袋中液于4℃、10 000 r/min离心10 min，获得的沉淀用含8 mol/L尿素的Tris-Cl缓冲液溶解。

1.2.4 串联多肽的胰蛋白酶酶切与纯化

将纯化的串联多肽用pH8.0的Tris-Cl稀释至0.5 mg/mL，加入终浓度为0.05 mg/mL的胰蛋白酶，37℃温浴反应4 h后，100℃加热10 min灭酶。反应液用Sephadex G－15纯化，检测波长为220 nm，上样量为2 mL，蒸馏水洗脱速度1 mL/min，由HW－2000色谱工作站系统记录洗脱曲线并收集洗脱峰。

1.2.5 多肽的结构鉴定

用Thermo LXQ质谱仪分析降血压肽的分子质量。离子源为ESI，质量扫描范围为50～1 200 u。一级MS扫描完成后，选择所需的肽段离子进行 MS/MS分析。

1.2.6 ACE抑制活性的测定

体外活性检测采用FAPGG分光光度法。FAPGG最大吸收峰在340 nm，经ACE酶解后变成FAP和GG，从而发生在340 nm的吸光度下降。通过测定吸光度变化速度可以计算出ACE酶的活性。样品具体加样体积和计算方法参照文献［9］进行。

1.2.7 IYPR的热稳定性

将溶液多肽IYPR的pH调至8.3，分别在25℃，37℃、50℃、70℃和90℃处理不同时间，冷却到室温后测其ACE抑制活性。

1.2.8 IYPR的酸碱稳定性

将溶液多肽IYPR的pH分别调至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0，然后在37℃保温不同时间，调回pH值到8.3，测定其ACE抑制活性。

1.2.9 IYPR的抗消化道酶酶解能力

参考Wu等［10］报道的方法，用0.1 mol/L HCl将多肽溶液的pH调到2.0，加入终浓度为0.1 mg/mL的胃蛋白酶，37℃保温2 h，然后用0.1 mol/L NaOH将多肽溶液的pH调至8.0，加入终浓度为0.1 mg/mL的胰蛋白酶，37℃保温4 h，沸水浴10 min，钝化酶，4 000 r/min离心10 min，取上清测定ACE抑制活性。

2 结果与讨论

2.1 重组蛋白的亲和层析纯化

重组蛋白含有6×His标签，Ni2+-NTA树脂具有同His融合蛋白高亲和力结合的特点。包涵体溶解液过亲和层析柱后，依次收集样品穿透液、洗杂液和洗脱液，经Tricine-SDS-PAGE分析，结果如图1所示。可见2号样品穿透液基本不含目的蛋白，3号洗杂液显示杂蛋白基本去除，4号为200 mmol/L咪唑洗脱液，为目的蛋白，其纯度达到90%。

图1 重组蛋白亲和层析纯化电泳图谱

2.2 重组蛋白的肠激酶酶切与标签的去除

上游His标签序列与目的肽通过肠激酶的酶切位点Asp-Asp-Asp-Asp-Lys连接，肠激酶可将融合蛋白中的His标签切下。电泳结果见图2。分子质量约为8.0 ku(2号条带)的重组蛋白经过酶切后形成了两个分子质量更小(3号条带)的蛋白，且切开的片段大小符合理论值，其中最小的片段是7个IYPR的串联体，分子质量约为3.7 ku。

经过酶切后，IYPR的串联体由于疏水性极强，在2 mol/L尿素的缓冲液中只有少量溶解，所以会沉淀析出。而肠激酶反应前，IYPR的串联体蛋白与标签结合在一起，标签的亲水性使得一定量的重组蛋白在2 mol/L尿素中可以顺利溶解。为了去除标签部分，使用透析脱盐法让串联多肽析出，标签留在溶液，然后经过离心得到目的肽。图2中4号带为析出的沉淀，为7个IYPR的串联体，纯度约为92%，5号带为上清液中的标签。

图2 重组蛋白的肠激酶酶切电泳图谱

2.3 Sephadex G-15纯化降血压肽

胰蛋白酶酶切后的样品用Sephadex G-15对其进一步分离纯化，洗脱曲线如图3所示。从图3可以看出，胰蛋白酶反应后的混合液经过Sephadex G-15纯化后只有一个主峰，由于胰蛋白酶浓度较小，所以胰蛋白酶的峰不是很明显。

图3 降血压肽Sephadex G-15凝胶层析图

2.4 多肽结构的鉴定

经二级质谱分析得到MS/MS图谱(图4)，根据可能产生的碎片可知，只要从图谱上找出3个y，即可确定该4肽的序列。由图可见，y1=175，y2=272，y3=435均可在图谱中找到，因此可以判定这个肽的序列为Ile-Tyr-Pro-Arg。

2.5 IYPR的热稳定性

不同温度处理对IYPR活性的影响如图5所示。从图5可以看出，当温度低于50℃时，IYPR的ACE抑制活性随时间的延长几乎保持不变;当90℃处理5 h时，其ACE抑制率仍然为初始值的90%。此试验结果表明:降血压肽IYPR具有较好的热稳定性。

2.6 IYPR的酸碱稳定性

图4 纯化多肽的MS-MS图谱

图5 温度对多肽IYPR活性的影响

不同pH对多肽IYPR活性的影响如图6所示。从图6可见，在37℃条件下，当处理pH为2～10时，IYPR的活性随时间的延长几乎保持不变;在处理pH为12时，IYPR的活性随时间的延长逐渐下降，当处理时间为5 h时，其ACE抑制率为初始值的87%。可以看出，降血压肽IYPR在酸性、中性和弱碱性条件下都很稳定，在强碱性条件下活性会下降。

图6 pH对多肽IYPR活性的影响

2.7 IYPR的抗消化道酶酶解能力

确定一个多肽是否为真正降血压肽，最直接的方法就是通过动物试验验证［11］，但这样会造成检测的繁琐和大量经费的浪费。在胃肠道消化酶作用下，多肽可能抵抗消化或降解失活，或产生新的ACE抑制肽［12］。所以在进行体内活性前，先进行体外模拟消化道环境研究十分必要。

多肽IYPR经过胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的活性如图7所示，结果显示，经过胃蛋白酶消化后，IYPR的ACE活性升高了13.0%，说明IYPR可能被降解为活性更强的物质，而经过胰蛋白酶消化后，其活性基本没有变化。因为在制备IYPR时就已经利用了胰蛋白酶将多肽串联体酶切成单体，所以胰蛋白酶消化处理对活性影响不大。

图7 消化道酶对IYPR的ACE抑制活性的影响

3 讨论

降血压肽IYPR的作用机理是作为竞争性抑制剂与ACE结合，使得血管紧张素II的生成和激肽的破坏均减少，从而达到降低血压的目的。IYPR最初是从米酒中分离提取得到的活性肽［13］，食品源的降血压肽降压温和、持久、安全可靠且对正常血压无影响，无副作用，同时具有减肥、免疫调节、易消化吸收等功能，具有良好的应用前景。但通过酶解从食品中提取得到纯度高的肽一般要经过很多分离纯化过程，产率也较低。本文通过基因工程法表达得到IYPR，经过几步纯化后，产品纯度较高，活性好。针对酶解制备降血压肽的不足，基因工程技术和微生物发酵手段为降血压肽的大规模生产带来了契机。

［1］Je J Y，Park J Y，Jung W K，et al.Isolation of angiotensin I converting enzyme(ACE)inhibitor from fermented oyster sauce，Crassostrea gigas ［J］.Food Chemistry，2005，90(4):809－814.

［2］Hata Y，Yamamoto M，Ohni M，et al.A placebo-controlled study of the effect of sour milk on blood pressure in hypertensive subjects［J］.American Journal of Clinical Nutrition，1996，64(5):767－771.

［3］Karaki H，Doi K，Sugano S，et al.Antihypertensive effect of tryptic hydrolysate of milk casein in spontaneously hypertensive rats［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Comparative Pharmacology，1990，96(2):367－371.

［4］Pihlanto A，Virtanen T，Korhonen H.Angiotensin I converting enzyme(ACE)inhibitory activity and antihypertensive effect of fermented milk［J］.International Dairy Journal，2010，20(1):3 －10.

［5］Jia J，Ma H，Zhao W，et al.The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein［J］.Food Chemistry，2010，119(1):336 －342.

［6］Qu W，Ma H，Pan Z，et al.Preparation and antihypertensive activity of peptides from Porphyra yezoensis［J］.Food Chemistry，2010，123(1):14－20.

［7］Hernández-Ledesma B，Recio I，Ramos M，et al.Preparation of ovine and caprine β-lactoglobulin hydrolysates with ACE-inhibitory activity.Identification of active peptides from caprine β-lactoglobulin hydrolysed with thermolysin［J］.International Dairy Journal，2002，12(10):805－812.

［8］Huang L，Ma H，Li Y，et al.Antihypertensive Activity of Recombinant Peptide IYPR Expressed in E.coli as Inclusion Bodies［J］.Protein Expression and Purification，2012，83(1):15－20.

［9］代春华，马海乐，赵圣惠，等.黄粉虫幼虫降血压肽酶解液脱色工艺的优化［J］.食品工业科技，2010，32(12):261－262.

［10］Wu J，Ding X.Characterization of inhibition and stability of soy-protein-derived angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides ［J］.Food Research International，2002，35(4):367－375.

［11］Wu J P，Ding X L.Hypotensive and physiological effect of angiotensin converting enzyme inhibitory peptides derived from soy protein on spontaneously hypertensive rats［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2001，49(1):501－505.

［12］Iroyukifujita H，Eiichiyokoyama K，Yoshikawa M.Classification and antihypertensive activity of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides derived from food protein［J］.Journal of Food Science，2000，65(4):564－569.

［13］Saito Y，Wanezaki K，Kawato A，et al.Structure and activity of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from sake and sake Lees［J］.Bioscience，Biotechnology，and Biochemistry，1994，58(10):1 767 －1 771.