高效液相色谱法测定美法仑中的有关物质

王增仙，甄会贤，高萧枫，武敏霞，李 平

(山西生物应用职业技术学院，山西太原 030031)

美法仑(又名L－溶肉瘤素)即左旋苯丙氨酸氮芥，是一种烷化剂。其基本作用同环磷酰胺，为双功能烷化剂及细胞周期非特异性药物，有细胞毒作用，并抑制蛋白质的合成，为苯丙氨酸氮芥的左旋体，抗瘤作用稍强于消旋体(即溶肉瘤素)。临床上美法仑可用于乳腺癌、卵巢癌、慢性淋巴细胞和粒细胞白血病、恶性淋巴瘤及多发性骨髓瘤等，动脉灌注可治疗肢体恶性肿瘤，如恶性黑色素、骨肉瘤及软组织肉瘤等。目前国内尚无美法仑的检测标准。为控制其质量，本文根据新药审批的有关规定要求，结合国外已有的标准，采用常用测定有关物质的高效液相色谱法考察美法仑中有关物质的检测方法［1～3］。

1 仪器与材料

日本岛津LC-10A高效液相色谱仪，岛津紫外分光光度仪UV-160，医用超声波清洗器 KQ320，恒温水浴锅，电子天平。

美法仑原料(自制)，对照品(中国药品生物制品检定所，批号:20081204)，乙腈为色谱纯，甲醇、氢氧化钠、盐酸、双氧水、碳酸铵、冰醋酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性实验

色 谱 柱:DiamonsilODS(4.6 mm× 150 mm，5 μm);流动相:0.375%碳酸铵的水溶液∶乙腈∶冰醋酸 (100∶35∶1.0);检 测 波 长:260 nm;流 速:1.0 mL/min;进样量:10 μL。理论塔板数按美法仑峰计不低于5 000，拖尾因子在0.95～1.05之间，与相邻峰的分离度大于1.5。色谱图见图1、图2、图3。

图1 空白溶液色谱图Fig 1 HPLC Chromatograms of the Blank Solution

图2 供试品溶液色谱图Fig 2 HPLC Chromatograms of the Sample

图3 对照品溶液色谱图Fig 3 HPLC Chromatograms of the Reference Diosgenin

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备 取本品适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成每1 mL中含0.2 mg的溶液，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称定美法仑对照品适量，加0.1 mol/L盐酸溶液配制成0.2 mg/mL的溶液作为储备液。精密量取储备液1 mL置于100 mL量瓶中，加0.1 mol/L盐酸稀释至刻度并摇匀，即得浓度为0.002 mg/mL的溶液。

2.2.3 空白溶液的制备 0.1 mol/L盐酸溶液。

2.3 方法

2.3.1 检测限和定量限的确定 调节色谱仪灵敏度，用0.1 mol/L的盐酸溶液配制一定浓度的美法仑溶液，并逐步稀释，边稀释边进样，每次10 μL，直到美法仑峰的峰高为基线噪音的10倍左右，记录色谱图，根据稀释倍数计算，得定量限为0.000 002 6 mg/mL，继续稀释，当美法仑峰的峰高为基线噪音的3倍左右时，记录色谱图，得检测限为0.000 000 8 mg/mL。

2.3.2 线性测定及范围 选择从定量限到1%自身对照浓度的120%作为本品的线性考察范围，本品的定量限为 0.000 002 6 mg/mL，1%自身对照浓度的120%为 0.002 4 mg/mL， 故 在 0.000 002 6 mg/mL～0.002 4 mg/mL范围内做线性实验。

精密称定美法仑对照品适量，加0.1 mol/L盐酸溶液配制成0.2 mg/mL的溶液作为贮备液。精密量取贮备液适量，用0.1 mol/L盐酸溶液分别稀释成浓度为0.000 002 6 mg/mL、0.000 2 mg/mL、0.001 mg/mL、0.002 mg/mL、0.002 4 mg/mL的溶液，进样分析。得线性方程:Y=7 000X+1 635，r=0.999 7。结果表明本品在0.000 002 6～0.002 mg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.3.3 仪器精密度实验 取对照溶液适量，连续进样5次，每次10 μL。以峰面积值计算相对标准偏差RSD为1.2%(n=5)。实验结果表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性实验 取供试品溶液适量，分别于配制后第0、1、2、3、5 h末进样分析，其峰面积的 RSD 为1.28%，表明供试品在5 h内稳定性良好。

2.4 回收率实验

采用加样回收率测定法，取本品适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶解并定量稀释制成每1 mL中含0.1 mg的溶液，共9 份，分别按50%、100%、150%精密加入对照品溶液适量各3份，按上述条件进样分析，计算加样回收率和RSD值。3个浓度的平均回收率分别为 100.8%、99.1%、98.6%;RSD 分 别 为 0.93%、0.52%、0.89%。

2.5 破坏性实验

2.5.1 氧化破坏实验 取本品约10 mg，加30%双氧水15 mL，于90℃加热2 min，滤过，取续滤液进样10 μL，结果表明降解产物峰明显增大，且有关物质峰和主峰达基线分离。色谱图见图4。

图4 氧化破坏色谱图Fig 4 HPLC Chromatograms of the Oxidative Damage

2.5.2 酸破坏实验 取本品约10 mg，加入0.1 mol/L盐酸溶液10 mL，于90℃加热40 s，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液中和至中性，滤过，进样10 μL，结果表明降解产物峰明显增加，且有关物质峰和主峰达基线分离。色谱图见图5。

2.5.3 碱破坏实验 取本品约10 mg，加入0.1 mol/L氢氧化钠溶液5 mL，于80℃加热40 s，用0.1 mol/L盐酸溶液中和至中性，滤过，进样10 μL，结果表明降解产物峰明显增加，且有关物质峰和主峰达基线分离。色谱图见图6。

图5 酸破坏色谱图Fig 5 HPLC Chromatograms of the Acid Damage

图6 碱破坏色谱图Fig 6 HPLC Chromatograms of the Base Damage

2.6 三批样品有关物质的检测

照上述色谱条件进行实验，分别取对照品溶液、供试品溶液10 μL注入液相色谱仪;记录色谱图至供试品溶液中美法仑峰保留时间的3倍;则供试品溶液中如有杂质峰(溶剂峰除外)，计算各杂质峰峰面积之和，测定结果见表2。

表2 3批样品有关物质测定结果Table 2 Determination Results of Related Substances in Three Batches of Samples

3 讨论

3.1 测定波长的选择

取本品原料分别用流动相溶液、0.1 mol/L的盐酸溶液，配制成适宜浓度的溶液，分别在190～400 nm波长范围内进行紫外扫描，美法仑的流动相溶液在260 nm处有最大吸收;其0.1 mol/L的盐酸溶液也在260 nm处有最大吸收，所以最终选择260 nm为有关物质的检测波长。

3.2 溶剂的选择

在有关物质的测定中，首选采用流动相溶解样品，经稳定性试验，发现本品在流动相溶液中稳定性不好，其有关物质自溶解后有逐渐增加的趋势，所以采用本品片剂溶出度测定的溶剂(0.1 mol/L盐酸)来溶解样品，检验有关物质，增加了溶液稳定性，且空白溶剂不影响测定。

［1］刘利军.反相高效液相色谱法测定普卢利沙星中的有关物质［J］.中南药学，2010，8(6):423-425.

［2］白玉红，韩 慧，于海威，等.盐酸氮卓斯汀片有关物质测定方法的研究［J］.中国当代医药，2009，16(12):115-116.

［3］张小松，江 生，毛 庆.磷酸哌喹有关物质的检测研究［J］.中国药事，2009，23(7):690-691.