星点设计－效应面法优化玄参提取工艺

周洪伟 郝丽静 杨 勇 张 林 杨 桃 周 坤 吴晓丹

(1北京中医药大学中药学院，100102;2河北大学中医学院;3北京中医药大学基础医学院)

玄参为玄参科植物玄参Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，其味甘、苦、咸，性微寒，功效清热凉血、滋阴降火、解毒散结。现代研究表明，玄参主要含环烯醚萜类、苯丙素苷类，尚含植物甾醇、有机酸类、黄酮类、三萜皂苷、挥发油、糖类、生物碱及微量的单萜和二萜成分等，其中哈巴俄苷在玄参中含量较高，是玄参的特征性有效成分［1～2］;哈巴苷与哈巴俄苷可调节免疫功能，保护血管内皮细胞，具有较广泛的药理活性［3－4］。本研究采用星点设计 － 效应面法(CCDRSM)研究玄参中哈巴苷与哈巴俄苷的提取工艺，优选的工艺简便可行，为该方法在中药提取工艺优化中的应用提供实验依据。

1 仪器与试药

HPLC系统:LC－10ATVP四元泵，DGU－14A脱气机，CTO－10TVP柱温箱，SPD －M10TVP检测器，SIL－10ADVP自动进样器，CLASS－VP色谱工作站(岛津公司);AUW120D电子分析天平(岛津)。

哈巴苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号:111729－200603);哈巴俄苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号:111730－201106);玄参药材(购自保定北京同仁堂药店有限责任公司);甲醇、乙腈(色谱纯);纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)。

2 方法与结果

2.1 哈巴苷与哈巴俄苷的HPLC测定

2.1.1 色谱条件 Agilent eclipse XDB－C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);乙腈为流动相 A，水为流动相B，按表1进行梯度洗脱;流速1mL·min－1;柱温30℃;检测波长哈巴苷210nm，哈巴俄苷278nm。

表1 流动相梯度洗脱方案

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取经五氧化二磷减压干燥36h的哈巴苷与哈巴俄苷对照品18.48mg、18.14mg，分别置10mL量瓶中，加甲醇定容，即得哈巴苷与哈巴俄苷对照品储备液。精密移取哈巴苷对照品储备液2mL、哈巴俄苷对照品储备液0.2mL，分别置于10mL量瓶中，加甲醇定容，即得哈巴苷与哈巴俄苷对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密称取玄参药材粉末(过三号筛)0.5065g，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50mL，密塞，称定重量，浸泡1h，超声处理45min，放冷，再次称定重量，用50%甲醇补足损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.4 线性范围 精密吸取哈巴苷对照品溶液1、2、4、8、10、20μL，哈巴俄苷对照品溶液 4、8、10、14、16、20μL，分别注入色谱仪，以峰面积(Y)对进样量(X)进行线性回归，得哈巴苷回归方程:Y=296990X+20638，相关系数:r=0.9999，线性范围:0.370 ～7.393μg;哈巴俄苷回归方程:Y=2769.6X+2984.7，相关系数:r=1，线性范围:145.1～725.6ng。

2.1.5 精密度试验 取对照品溶液，连续进样6次，测得哈巴苷与哈巴俄苷的RSD分别为2.26%和0.22%。

2.1.6 准确性试验 哈巴苷加样回收率为(96.77±2.33)%，RSD为2.41%(n=6)，哈巴俄苷加样回收率为(96.40±2.30)%，RSD为2.39%(n=6)。

2.1.7 药材含量测定 依2.1.1项下方法测定玄参药材中哈巴苷和哈巴俄苷含量，哈巴苷含量为0.35%，RSD=1.47%(n=3)，哈巴俄苷含量为0.12%，RSD=0.24%(n=3)。玄参药材含量符合《中国药典》一部(2010版)项下规定。

表2 因素水平表

表3 实验设计与结果

2.2 玄参中哈巴苷与哈巴俄苷的提取工艺研究 在预实验基础上，选择提取溶剂(%)X1、液料比X2和提取时间(min)X3为考察因素，以哈巴苷与哈巴俄苷总提取率(Y)为指标进行CCD－RSM法优化，实验设计与结果见表2～表3。

采用Design－Expert 8.0软件处理数据，有:

直线回归方程为:

二元回归方程为:

多元回归方程为:

由以上方程可知，多元回归方程的拟合效果最好。采用OriginPro 8.0软件绘制三维效应面图，考察X1、X2、X3三个因素对Y的影响，如图1所示。

图1 星点设计－效应面图

2.3 最优工艺验证 由CCD－RSM法优选玄参的提取工艺条件为:X1=18% ～32%，X2=20∶1 ～26∶1，X3=30～48min;按优选工艺提取玄参药材3批，依2.1项下方法测定其总提取率，结果见表4，数学模型满足预测要求。

表4 玄参药材总提取率验证结果(n=3)

3 讨论

目前中药提取工艺优化多采取正交设计或均匀设计法，这两种方法多采用线性数学模型，实验次数较少，精度不高。效应面法系通过描绘效应对考察因素的效应面，从效应面选择较佳的效应区，从而回推自变量取值范围即最佳实验条件的一种研究方法。实验设计可采用星点设计，该方法适用于非线性模型拟合，且具有良好的预测性［5］。本实验引入星点实验设计方法，结合效应面法优选玄参中哈巴苷与哈巴俄苷的提取工艺，取得了良好的效果。

［1］胡瑛瑛，黄真.玄参的化学成分及药理作用研究进展［J］.浙江中医药大学学报，2008，32(2):268 －270.

［2］季金玉，张云，丛晓东，等.玄参的化学成分及质量控制研究进展［J］.中华中医药学刊，2010，28(12):2507 －2510.

［3］谢丽华，刘洪宇，钱瑞琴，等.哈巴苷与哈巴俄苷对阴虚小鼠免疫功能及血浆环化核苷酸的影响［J］.北京大学学报(医学版)，2001，33(3):283－284.

［4］崔忠生，邸科前，马焕云.哈巴苷及哈巴俄苷对肾上腺素损伤血管内皮细胞的保护作用［J］.山东医药，2009，49(25):60 －61.

［5］吴伟，崔光华，陆彬.实验设计中多指标的优化:星点设计和总评“归一值”的应用［J］.中国药学杂志，2000，35(8):530 －533.