盆炎汤对感染解脲脲原体小鼠生殖细胞凋亡的影响

左 玲 贝鹏剑 胡国华

(上海中医药大学附属上海市中医医院妇科，上海市闸北区芷江中路274号，200071)

解脲脲原体是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，它不仅引起NGU，还可导致盆腔炎、不孕症、自然流产、早产、妊娠期感染、新生儿感染等疾病。近年来，在临床上中药治疗支原体的优势越来越受到重视。胡国华教授进行中草药体外抗Uu的药敏研究，发现清热解毒类的中药具有较好的抗支原体作用［1－2］，盆炎汤是名老中医朱南孙教授治疗慢性盆腔炎的经验方，临床上疗效确切。现将2009年9月至2010年3月于上海市中医医院中心实验室所做的动物试验——盆炎汤治疗Uu感染小鼠生殖系统的疗效报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性昆明种小鼠，体重(30±2)g，清洁级，8～10周，共63只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。63只小鼠随机分为7组，每组9只。1)正常组:注射雌激素，不接种Uu菌液;2)模型组:注射雌激素，阴道接种Uu菌液;3)西药组:注射雌激素，阴道接种Uu菌液;4)中西药结合组:注射雌激素，阴道接种Uu菌液;5)盆炎汤大剂量组:注射雌激素，阴道接种Uu菌液;6)盆炎汤中剂量组:注射雌激素，阴道接种Uu菌液;7)盆炎汤小剂量组:注射雌激素，阴道接种Uu菌液。

1.2 试剂及药品 Uu液体无菌培养液、Uu固体无菌培养基(以上均由上海恩康生物科技有限公司提供)，血清8型Uu菌株(购于美国菌种收藏中心，复苏传代)，阿奇霉素片(规格:0.25g/片，湖北广济药业股份有限公司生产，批号:20090201)(参照2006年美国疾病预防控制中心性病治疗指南专辑)，苯甲酸雌二醇(规格:2mg/mL，上海通用药业股份有限公司生产，批号:070402)，中药盆炎汤组成:蒲公英30g，红藤30g，延胡索15g，刘寄奴12g，续断12g。煎煮浓缩后计算得所浓缩的最大浓度约为4.5g/mL。(上海市中医医院提供)。

1.3 方法

1.3.1 造模 参照文献造模［3－4］:1)所有小鼠颈部皮下均注射苯甲酸雌二醇0.4mg/只，每周1次，共4次;2)所有小鼠注射雌激素1周后，除正常组外，其余小鼠均感染Uu。用微量移液器吸取处于对数生长期的Uu菌液50μL，伸入小鼠阴道约0.5cm，将Uu菌液缓缓注入小鼠阴道内，注入完毕后将小鼠倒置半分钟，使Uu菌液能充分与生殖道内壁接触。1周后取小鼠阴道分泌物进行培养，显微镜下观察到Uu菌落表明造模成功。

1.3.2 药物治疗 造模成功后开始用药。1)正常组:无菌纯净水灌胃0.5mL/次×14d;2)模型组:无菌纯净水灌胃0.5mL/次×14d;3)西药组:阿齐霉素0.21g/kg，灌胃、顿服;4)中西药结合组:阿齐霉素0.21g/kg，顿服;盆炎汤小剂量灌胃×13d;5)盆炎汤大、中、小剂量组:分别用4.5g/mL、2.25g/mL、1.13g/mL的中药汤剂灌胃0.5mL/次×14d。

1.3.3 观察 实验过程中观察小鼠的饮食、饮水情况，体重变化，毛色变化，生殖道分泌物及大小便情况。

1.3.4 白介素检测 处死小鼠前采用股动脉取血法，将所取血液及时离心后取上清液，采用双抗体夹心ABC－ELISA法检测小鼠血清中白介素－1β、白介素－6的浓度。

1.3.5 凋亡 实验结束处死各组小鼠，剖腹，肉眼观察小鼠阴道分泌物、子宫等腹腔内情况。取部分阴道、子宫组织，用10%甲醛固定，做病理HE染色，切片。用TUNEL法检测小鼠阴道、子宫组织凋亡细胞数量。

1.3.6 统计分析 利用SPSS18.0软件完成，采用方差分析方法(剔除偏差太大的数值，检测方差齐)。

2 结果

2.1 观察结果 接种Uu菌液后第2～3周小鼠的饮水量明显增加，阴道周围红肿，分泌物增多，个别小鼠生殖道周围有脱毛伴液体渗出现象。小鼠的尿液气味臭秽，尿量增多，色黄。处死小鼠时发现部分小鼠有子宫增粗、水肿，子宫壁变薄，剪开子宫组织可见有腔内有透明液体流出，部分小鼠有子宫变硬的现象。也可见小鼠膀胱内脓性分泌物，膀胱壁变厚，甚则坏死。

2.2 白介素－1β及白介素－6比较结果 经F检验，白介素－1β模型组、西药组及中药小剂量组与正常组相比较有统计学意义(P＜0.05)，从均值可以看出，中西药结合组、中药大、中剂量组的白介素－1β较其他组有降低的趋势;白介素－6各干预组存在较模型组降低的趋势，其中中药大剂量组的降低最为明显，见表1。

表1 白介素－1β及白介素－6比较(±s)

表1 白介素－1β及白介素－6比较(±s)

注:模型组、西药组、中药小剂量组与正常组比较，*P＜0.05。

组别 例数 IL－1β(pg/mL) IL－6(pg/mL)8 29.37±16.41 29.38±19.51模型组 8 45.47±11.72* 30.22±11.05西药组 9 47.60±20.27* 26.29±9.21中西药组 9 36.65±10.33 24.15±7.08中药大剂量 9 39.43±13.73 27.89±8.69中药中剂量 8 34.0±9.93 26.78±8.20中药小剂量 9 47.10±16.68*正常组27.67±6.97

2.3 各组小鼠子宫组织及阴道组织凋亡比较结果从均值可以看出子宫组织细胞凋亡率干预各组存在较模型组降低的趋势，尤以西药组、中西药组、中药大剂量组为明显。与模型组相比较各组阴道组织细胞凋亡率均有明显降低的趋势，且以中药大剂量组最为明显。见表2。

表2 各组小鼠子宫组织及阴道组织凋亡比较(±s)

表2 各组小鼠子宫组织及阴道组织凋亡比较(±s)

注:正常组、中西药组、中药大剂量组与模型组比较，＊＊P＜0.01;西药组、中药中小剂量组与模型组比较，*P＜0.05。

组别 例数 子宫组织 阴道组织正常组 8 7.11±2.80 5.74±2.80＊＊模型组 8 7.38±3.03 9.88±3.00西药组 9 6.41±1.97 7.53±1.91*中西药组 9 5.31±0.94 6.89±2.57＊＊中药大剂量 9 5.46±1.86 5.93±1.59＊＊中药中剂量 8 6.91±2.41 7.01±1.20*中药小剂量 9 5.96±1.22 7.26±2.39*

3 讨论

细胞凋亡是1972年首先由英国科学家Kerr提出的，细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，但是细胞凋亡过多将导致组织损伤和功能紊乱。支原体细胞膜中含有丰富的脂蛋白，称为脂质相关膜蛋白，有学者认为支原体的致病性可能与该膜蛋白有关。支原体LAMPs主要通过直接致病作用和免疫损伤等机制参与宿主细胞的损伤和凋亡［5］，LAMPs能影响淋巴细胞和单核细胞膜的通透性，从而诱导这些细胞释放ATP，后者能与免疫细胞膜上的P2嘌呤受体结合，从而诱导细胞凋亡或坏死［6］。LAMPs具有很强的抗原性，并能以较高的频率发生相变异。它可以刺激人单核细胞、巨噬细胞等分泌肿瘤坏死因子－a、白介素－1β、白介素－6，而肿瘤坏死因子－a、白介素－1β等都是前炎症的细胞因子，是启动急性炎症反应的关键性细胞因子，是启动细胞凋亡的重要细胞因子，与细胞凋亡关系密切［7－10］。本实验中观察到Uu感染小鼠不同程度的出现膀胱病变、子宫组织水肿等，及白介素－1β浓度模型组、西药组及中药小剂量组与正常组相比较有统计学意义(P＜0.05)，说明Uu感染后可以上行感染，刺激炎症反应。张迅［11］等研究表明Uu可致生殖细胞凋亡增加，阴道组织细胞凋亡各组与模型组相比较均有统计学意义，其中正常组、中西药组、中药大剂量组与模型组相比较有统计学意义(P＜0.01)，西药组、中药中、小剂量组与模型组相比较有统计学意义(P＜0.05);说明Uu感染后阴道组织细胞凋亡增加，用药后可以减少炎症反应，从而抑制细胞凋亡的产生，其中以中西药结合及中药大剂量对阴道组织细胞的凋亡抑制作用最为显著;西药、中药中、小剂量对阴道组织细胞的凋亡也有抑制作用。均值提示子宫组织细胞凋亡干预各组存在较模型组降低的趋势，尤以西药组、中西药组、中药大剂量组为明显;阴道组织细胞凋亡各组与模型组相比较均有明显降低的趋势，中药大剂量组降低最为明显。

综上，盆炎汤可以抑制白介素－1β及白介素－6的产生，从而减轻支原感染炎症反应所造成的病理损伤，降低支原体感染所造成的生殖细胞凋亡，并且这种作用随着用药剂量的增加而增强。

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