老年头颈部鳞状细胞癌中Mir-301a对PTEN基因表达的调控

许 颖 曹明根 (上海市徐汇区中心医院耳鼻喉科，上海 200031)

老年头颈部鳞状细胞癌中Mir-301a对PTEN基因表达的调控

许 颖 曹明根 (上海市徐汇区中心医院耳鼻喉科，上海 200031)

目的 研究老年头部和颈部鳞状细胞癌(HNSCC)的分子机制。方法 利用基因组浏览器分析基因之间关系，并基于RealtimePCR检测头颈部鳞状细胞癌及癌旁样本中SKA2、PIK3CA、AKT1、mir-301a、PTEN基因表达量。结果 发现mir-301a具有调控PTEN基因的靶向结合位点。RealtimePCR检测发现癌旁组织中各个指标在不同的临床分期间没有显著性差异，但是癌组织中SKA2、PIK3CA、AKT1、mir-301a基因表达随着肿瘤的恶化显著增强，而PTEN的表达量则显著下降。结论 PI3K/Akt信号通路异常活化导致肿瘤的发生、发展。

头颈部鳞状细胞癌;PTEN;Mir-301a;SKA2;PI3K/Akt

头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是一类临床、病理、表型及生物学等多样性表现的复杂疾病，鳞状上皮的细胞及分子结构发生改变是导致癌症发生和发展的原因，其发病过程呈现由正常黏膜过度增生、异常增生、轻度、中度和重度原位癌、浸润癌及癌转移的多步骤过程。这一多步骤演变过程的每一阶段都与一组相关分子发生变化有关〔1，2〕。本文通过基因组浏览器定位基因及TargetScan数据库预测MicroRNA的靶基因，并通过基因表达水平的检测推断在HNSCC发生与发展过程中的相关分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

随机收取我院病理科平均年龄(55±4.2)岁的头颈部鳞状细胞癌及癌旁样本22例，其中Ⅰ期患者3例，Ⅱ期4例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。

1.2 方法

总RNA抽提选用invitrogen公司的Trizol试剂，基因逆转录选用罗氏的RNA逆转录试剂盒，MicroRNA检测选用Takara公司的MicroRNA qPCR检测试剂盒。相关基因的检测引物设计见表1。成熟miRNA的表达水平检测也采用SYBR green法。特异性引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，自备通用引物为miScript SYBR Green PCR Kit。前两者构成 miRNA 引物(见表1)，miRNA表达采用2－ΔΔCT法计算，U6 snRNA(GenBank Entrez：M14486)为内参。采用 miScript Reverse Transcription计算KitmiRNA逆转录。在PCR管中加入5倍 RT 缓冲液 2 μl，总 RNA 1 μg，逆转录混合液 0.5 μl，Rnase free水补充至体积10 μl，混匀置于冰上。逆转录反应95℃5 min，37℃ 60 min，保存温度 －20℃。试剂盒采用 miScript SYBR Green PCR Kit，利用ABI 7300 RealTime PCR仪实施PCR反应，反应体系：2 × SYBR Green mix 10 μl。10 ×miSeript通用引物 2 μl，10 × 特异引物 2 μl，稀释 cDNA 1 μl，Rnase free 水至体积20 μl。反应条件：95℃预反应15 min;94℃15 s 55℃ 30 s 70℃ 34 s，共进行40个循环。

2 结果

2.1 SKA2及has-mir-301a的基因组定位

SKA2基因定位在人17号染色体长臂22区反义链上，其1号内含子中含有hasmir-301a的前体序列，has-mir-301a随ska2基因共同转录，并在SKA2内含子剪切之后加工为成熟的MicroRNA。

表1 检测基因及MicroRNA的引物设计

2.2 has-mir-301a与PTEN基因的靶向调控关系

通过TargetScan数据库发现mir-301a在PTEN的3'UTR区存在多个结合位点，这些位点为mir-301a调控PTEN基因的表达提供了基因结构上的支持。见图1。

图1 has-mir-301a与PTEN基因靶向结合位点分析

2.3 基因表达及mir-301a表达的qPCR检测

通过RealTime PCR 的方法检测了SKA2、PIK3CA、AKT1、PTEN、GAPDH 及 mir-301a和 U6的表达量，以 GAPDH为内参，分析了 SKA2、PIK3CA、AKT1、PTEN基因表达水平;以U6为内参，分析了mir-301a的表达水平。

通过分析发现，在癌旁组织中各个指标在不同的临床分期间没有显著性差异，这可能与癌旁组织更接近与正常组织有关。而在癌组织中，随着肿瘤的恶化，调控细胞分裂的SKA2基因表达显著增强，而抑癌基因PTEN的表达量则显著下降，这也伴随着mir-301a表达的逐步增强。另外，PTEN抑制的下游PI3k/AKT通路被明显激活。通过基因表达的关联性分析发现mir-301a与SKA2显著正相关，相关系数为0.985，而PTEN则与SKA2显著负相关，相关系数为－0.951，PTEN与mir-301a、PIK3CA、AKT1在表达上均具负相关性，分别为 －0.935、－0.895、－0.946。见表2。

表2 癌与癌旁组织中各基因相对表达值±s)

表2 癌与癌旁组织中各基因相对表达值±s)

基因 Ⅰ期癌旁 癌Ⅱ期癌旁 癌Ⅲ期癌旁 癌Ⅳ期癌旁 癌01±0.03 3.17±0.13 1.01±0.03 3.78±0.16 PTEN 1±0.02 1.00±0.05 1.10±0.03 0.83±0.06 1.00±0.03 0.73±0.05 1.01±0.02 0.27±0.03 PIK3CA 1±0.03 1.42±0.09 1.01±0.04 1.79±0.23 1.02±0.04 3.03±0.20 1.01±0.05 3.76±0.22 AKT1 1±0.01 1.37±0.09 1.01±0.02 1.72±0.13 1.02±0.04 2.96±0.12 1.02±0.03 3.54±0.16 mir-301a 1±0.00 1.49±0.06 1.00±0.03 2.64±0.SKA2 1±0.02 1.66±0.13 1.03±0.01 2.81±0.10 1.05 0.99±0.03 2.65±0.11 1.01±0.03 3.75±0.13

3 讨论

PTEN基因是具有磷酸酶活性的抑癌基因，定位于染色体10q23.3上，共有 9个外显子，长 1 212 bp，mRNA长度为5.5 kb〔3〕。许多癌基因产物、受体有酪氨酸蛋白激酶活性及生长因子，使细胞内靶蛋白的酪氨酸残基磷酸化，从而影响细胞的繁殖发育、生长分化等功能。PTEN可以将磷酸根从这些蛋白中除去，对细胞增殖起负调控作用;对磷酸酪氨酸蛋白、磷酸丝氨酸/苏氨酸蛋白、3，4，5三磷脂酰肌醇均有脱磷酸作用〔4〕;抑制细胞增殖和增加细胞凋亡〔5〕。SKA2为纺锤体与着丝粒连接复合物2亚基，具有调控微管聚合和解聚的功能，参与细胞周期及有丝分裂，位于人17号染色体长臂22区，位于反义链，具有4个外显子和3个内含子，有3种可变剪切方式(UCSC)，其一号内含子中还有mir-301a。mir-301a与SKA2共用一个转录启动区，随SKA2的转录而转录，并在SKA2内含子剪切之后加工成熟。Cao等〔6～8〕在不同的细胞中均已验证出mir-301a是随SKA2基因转录而转录的。MicroRNAs(miRNAs)是由具有发夹结构的约70～90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的具有21～23个碱基的单链小分子RNA，不同于siRNA(双链)但是和siRNA关系密切。这些非编码小分子RNA(miRNAs)很可能参与调控基因表达〔9〕。Mir-301a在结构上与PTEN的3'UTR区具有互补性的结合位点〔10〕，且二者在本文所检测的样本中有很强的负相关性，这就提示了PTEN的表达可能是受到了mir-301a的调控。在HNSCC发生及发展过程中伴随着PI3K/AKT通路的异常活化，而AKT的激活会抑制下游的凋亡相关基因Bax，激活凋亡抑制基因Bcl2，而该通路的活化会激活细胞的增殖能力，抑制细胞凋亡，这在 Bonavida等〔11，12〕的研究中均有相同的发现。通过本研究提出一个假设，即在HNSCC发生及发展过程中，可能是由于SKA2的异常激活，共表达了mir-301a，从而抑制了抑癌基因PTEN的表达，引起了PI3K/AKT通路的异常激活，最终促进了头颈部鳞状细胞的增殖而抑制了细胞的凋亡，从而使头颈部鳞状细胞发生癌变并逐渐恶化。而这还需要进一步的实验来证明。

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R739.6

A

1005-9202(2012)22-4967-02;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.22.053

许 颖(1973-)，女，主治医师，主要从事耳鼻喉科疾病的诊治研究。

〔2012-01-15收稿 2012-02-10修回〕

(编辑 袁左鸣)