豆类发酵液抑制马铃薯浆液褐变的研究

徐 涵 周 丽 华汉威 王清章

(华中农业大学食品科技学院，武汉 430070)

豆类发酵液抑制马铃薯浆液褐变的研究

徐 涵 周 丽 华汉威 王清章

(华中农业大学食品科技学院，武汉 430070)

为了找到抑制褐变的替代方法，采用豌豆自然发酵液来进行抗褐变和抑制马铃薯多酚氧化酶(PPO)活性的研究，并对其抗褐变机理和发酵条件进行了初步的探索。结果表明，豌豆自然发酵液可以有效的抑制马铃薯浆液褐变;有机酸并不是影响发酵液抗褐变的主要因素，它能够抗褐变是因为它可以抑制PPO的活性。通过单因素以及正交试验，确定了豌豆自然发酵液的最佳发酵条件:发酵时间为2 d，发酵温度为30℃，料水比为1∶5。经过验证，按最佳发酵条件得到的发酵上清液对PPO的抑制率可高达95.21%。

豌豆 自然发酵 褐变 多酚氧化酶(PPO)

马铃薯是茄科茄属一年生草本植物，其块茎可以供食用，是重要的粮食、蔬菜兼用作物。它富含碳水化合物、蛋白质、维生素、矿物质及人体必需氨基酸等营养成分，有“地下苹果”之美称［1］。鲜切马铃薯是一种新型的马铃薯初加工制品，因食用方便、快捷而备受消费者青睐［2］。然而马铃薯在经过鲜切后，其多酚氧化酶(PPO)催化内源多酚类底物氧化成醌类物质，醌类物质进一步聚合成黑色素，从而导致鲜切马铃薯发生褐变现象，严重的影响其感官质量和商品价值。

目前，生产上用亚硫酸盐、柠檬酸、抗坏血酸(VC)、铝(硼或锌)化物等化学试剂来抑制酶促褐变［3］，或者对已褐变的产品进行漂白粉漂白或二氧化硫熏白，但这些处理方法，有的具较强残留毒性(如 SO2、Cl－、A13+等)，危害人体健康;而有的则效果不佳，价格昂贵［4］。而生物抗褐变剂近些年来受到了人们的广泛关注和重视，利用有益菌及其代谢产物来防腐抑菌、保鲜抗褐变的研究方兴未艾。在这种趋势下，希望通过本试验能够深入发掘微生物发酵液的防褐变潜能，使其能够在生产应用中发挥应有的作用。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

马铃薯、豌豆:华中农业大学菜市场。

邻苯二酚、儿茶素、表儿茶素、绿原酸:Sigma公司。

722N型可见光分光光度计:上海光谱仪器有限公司;高速冷冻离心机:美国Backman公司;生化培养箱:北京泰斯特仪器有限公司;恒温水浴锅:北京东方精瑞科技公司;AL204分析天平:海梅特勒－托斯多仪器有限公司;豆浆机:移日本松下电器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 豌豆发酵液的制备及马铃薯褐变度(BD)的测定

豌豆洗净后清水浸泡一晚，按1∶10加水打浆过滤，滤液放入三角瓶中密封，于恒温培养箱中(25℃左右)静置2～3 d，待发酵液的颜色由白变黄，气味变酸，pH 4.6左右时即可，在12 000 r/min，4 ℃条件下离心15 min，取其上清液备用。

参照文献［5］并加以改进，马铃薯去皮清水冲洗后粗碎，按照1∶10加水(预冷)打浆，迅速过滤，滤液要现配现用。取豌豆发酵上清液0、1、2、3、4 mL分别装入10 mL量筒并补水至4 mL，然后加入马铃薯浆液至10 mL刻度，混匀静置10 min后于10 000 r/min，4℃条件下离心15 min，所得上清液在25℃水浴中保温5 min，用分光光度计测定其吸光值，结果以A410×10表示，平行测定3次，取平均值。试验测定时分别以0、1、2、3、4 mL发酵上清液补水至10 mL作为对照。

1.2.2 酚类物质自氧化的测定

分别准确称取5.00 mg邻苯二酚、绿原酸、儿茶素和表儿茶素，用100 mL，pH 6.5缓冲溶液溶解，酚类浓度为50 mg/L。各取10 mL于试管中，加入不同量的发酵上清液并补蒸馏水至20 mL。37℃水浴中保温3.5 h，选择波长为420 nm，测定吸光值。平行测定3次并取平均值。以相同的酚类溶液加10 mL蒸馏水做空白对照［6］。

1.2.3 马铃薯多酚氧化酶(PPO)的粗提取和活性的测定

参照文献［7］并改进:马铃薯清洗去皮，取5 g左右切碎后加入一定量预冷的pH 6.5，0.1 mol/L磷酸缓冲液，冰浴研磨(研钵在－20～－25℃条件下预冷2～3 h)后迅速在7 500 r/min，4℃条件下离心20 min。所得上清液即为马铃薯多酚氧化酶(PPO)的粗酶液。

采用消光值法。参照文献［8］并加以改进，不同量的发酵上清液中加入pH 6.5的磷酸缓冲液至3 mL处，然后加入2 mL，0.2 mol/L的邻苯二酚。25℃下保温5 min，再加入1 mL的粗酶液，迅速混匀后在410 nm波长下记录吸光值的变化。每0.5 min记录1次吸光值，共计3 min，重复测定3次。一个酶活力单位(U)定义为测定条件下每分钟引起吸光值增加0.001所需的酶量。

1.2.4 有机酸对马铃薯浆液BD值影响的测定

取pH 5.0的乳酸、柠檬酸，100 mg/L抗坏血酸溶液以及发酵液(调节至pH 5.0)各4.0 mL，分别加入到6.0 mL的马铃薯浆液中，混匀静置后按照1.2.1的方法测定其BD 值。

1.2.5 自然发酵工艺

选取了发酵时间、发酵温度和料水比这3个因素分别进行单因素试验，然后选取各因素中影响较大的水平来进行正交试验从而确定发酵的最佳条件。以3 mL发酵上清液对PPO的抑制率来评价发酵液的效果。正交试验因素水平设计表见表1。

表1 因素水平表

1.3 数据处理

采用SPSS软件对所得的数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 发酵上清液的防褐变试验

分别取不同量的发酵上清液加入到马铃薯浆液中，混合均匀并离心后测定其褐变度(BD)值。

从表2可以看出，马铃薯浆液在用豌豆发酵上清液处理后，其褐变度(BD)下降，而且随着上清液量的增加，BD值呈现下降的趋势。在没有加入上清液时，马铃薯浆液的BD值为1.91;而当加入1.0 mL的上清液后BD值下降到1.79;而加入4.0 mL后，其BD值下降到只有0.83。经过统计分析，其曲线回归方程为 y=2.050 6e－0.22x，其中 R=0.960 3 ＞ R0.01=0.959，所以上清液加量与马铃薯浆液的褐变度(BD)呈极显著的负相关。这表明豌豆发酵上清液能够有效抑制马铃薯浆液的褐变。

表2 上清液对褐变度的影响

2.2 发酵上清液抑制酚类物质试验

酶促褐变反应的发生需要3个条件:酚类底物、酶类物质和氧。酚类物质是酶促褐变的重要底物，其种类繁多包括邻苯二酚(儿茶酚)、绿原酸、咖啡酸、没食子酸等［5］。由于不知道发酵上清液是直接作用于酚类物质而抑制其氧化，还是抑制多酚氧化酶的活性，故用上清液分别验证。图1是发酵上清液对不同酚类物质自氧化的影响。

图1 上清液对酚类自氧化的影响

从图1可见，随着上清液加入量的增加，4种酚类溶液的吸光度变化呈上升趋势。这说明对于酚类的自氧化作用，上清液并不能起到抑制效果，反而会促进酚类的自氧化。其原因可能是因为上清液的pH比较低(约pH 4.6)，加入上清液后降低了溶液的pH，从而促进了酚类的自氧化。

2.3 发酵上清液抑制多酚氧化酶(PPO)试验

多酚氧化酶(PPO)催化酚类物质的氧化。PPO的系统命名是邻二酚:氧－氧化还原酶，该酶以铜为辅基，是一种含铜蛋白质，其相对分子质量约为34 000，必需以氧气为受氢体，是一种末端氧化酶［9］。

图2 上清液对PPO活性的影响

从图2可以明显的看出，当上清液的加入量增大时，其对马铃薯PPO的抑制率也随之增大，即对马铃薯PPO活性的抑制作用增大。当加入发酵液体积为0.5 mL时，其对PPO活性的抑制率为33.67%;而当加入3 mL时，对 PPO活性的抑制率则高达88.25%，此后发酵液的加入量再增大时，PPO抑制率的变化不大。这说明发酵液可以有效的抑制马铃薯PPO的活性。

2.4 有机酸对马铃薯浆液BD值的影响

为了验证是否发酵液中所含的有机酸对抗褐变起作用，选取pH 5.0的乳酸、柠檬酸，100 mg/L抗坏血酸溶液和发酵液(调节至pH 5.0)来进行抗褐变试验。

表3 有机酸对褐变度的影响

根据表3可以看到，pH 5.0的发酵液有较好的抑制褐变的效果，可以显著的降低马铃薯浆液的BD值，而且发酵液组的BD值为0.81，小于抗坏血酸组的BD值，说明其抗褐变效果比抗坏血酸更好。柠檬酸组与蒸馏水组的BD值大致相同，而乳酸不仅没有起到防褐变效果，其BD值比蒸馏水对照组还要大。这可能是因为加入乳酸、柠檬酸溶液后整个溶液体系的pH值上升到了5.5左右，而马铃薯PPO的活性在pH 5.5时达到最大;再加上它们的浓度太低，在一定程度上起到了激活PPO的作用。因此发酵液能够抑制褐变并不是其中的有机酸起主导作用，但是这些有机酸的存在降低了发酵液的pH，有助于发酵液对马铃薯PPO活性的抑制，至于是何种物质起着抑制褐变的效果则还需要后续试验来加以验证。

2.5 豌豆自然发酵液的工艺试验

因为发酵的方式为自然发酵，影响因素有很多，现选取自然发酵温度，自然发酵时间和料水比这3个条件进行单因素和正交试验，寻找最好的发酵条件来提高发酵液的抗褐变效果。

2.5.1 自然发酵时间对抑制 PPO活性的影响

在发酵温度为25℃，料水比为1∶10时，选取的发酵时间分别为 1、2、3、4、5 d，研究经过不同时间的发酵，发酵上清液对PPO活性的影响。

图3 不同发酵时间的上清液对PPO的影响

从图3中可以看出，随着上清液加入量的增加，对PPO的抑制率增大，PPO的活性降低。经过不同时间的发酵，上清液对PPO的抑制率不同。经过5 d的发酵，上清液对PPO的抑制效果和3 d的相差不大，而在发酵4 d后的效果最好。

2.5.2 自然发酵温度对抑制 PPO活性的影响

在发酵时间为3 d，料水比为1∶10时，选取的发酵温度分别为20、25、30和35℃，研究在不同的发酵温度下，发酵液对PPO活性的影响。

图4 不同温度发酵的上清液对PPO的影响

从图4可以看到，随着上清液加量的增加，PPO抑制率增大，其活性越来越小。在不同的发酵温度下，上清液对PPO的抑制作用不同。20℃发酵条件下，上清液对PPO的抑制作用最小;而在30℃发酵条件下，其对PPO的抑制效果最好。

2.5.3 料水比对酸浆抑制PPO活性的影响

在发酵时间为3 d，发酵温度为25℃时，选取的料水比分别为 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20，研究在不同的料水比条件下进行自然发酵，发酵上清液液对PPO活性的抑制效果。

图5 不同料水比的上清液对PPO的影响

根据图5可以看出，不同料水比的豌豆浆液发酵后，上清液对PPO的抑制作用差异很大。当料水比为1∶20时，对PPO的抑制作用最小;而料水比为1∶5时，对PPO的抑制作用最好，而1∶10时抑制效果和1∶5时差异不是很大。

2.5.4 正交试验

为了确定最佳的发酵条件，现以发酵时间、发酵温度、料水比这3项因素，分别设计3个水平进行正交试验［10－12］，正交试验结果及方差分析见表4和表5。

表4 正交试验结果

表5 方差分析

经过对表4和表5的分析可知，影响上清液抑制PPO效果的因素顺序为C＞A＞B。其中料水比的F值为 61.071 8，大于 F0.05(2，2)=19，因此具有显著性影响;而发酵时间，发酵温度的 F值分别是1.268 0，0.970 9，都小于 F0.10(2，2)=9，因此各个水平间无显著的差异，对发酵液效果的影响相对较弱。最后确定了发酵的最佳条件为A1B2C1，即发酵时间为2 d，发酵温度为30℃，料水比为1∶5。经过验证，按最佳发酵条件得到的上清液，3 mL对PPO活性的抑制率为 95.21%。

3 结论

用发酵液分别对马铃薯浆液、多酚类物质和马铃薯PPO进行抑制试验。向马铃薯浆液中加入发酵液后其BD值为0.83，而未加发酵液的BD值为1.91，这说明发酵液可以有效抑制马铃薯浆液的褐变;发酵液的加入量越多，多酚溶液吸光值增加越大，它的自氧化速度越快，表明发酵液不能抑制多酚物质自氧化，反而对其有促进作用;发酵液对马铃薯PPO活性有较好的抑制效果，当加入3 mL时，对PPO的抑制率可以达到88.2%;发酵液能够抑制褐变并不是其中的有机酸起主导作用，但是这些有机酸降低了发酵液的pH，有助于对马铃薯PPO活性的抑制。由以上可以初步的推断，发酵液能够抗褐变是因为它可以有效的抑制PPO的活性。

为了得到抗褐变效果较好的发酵液，对发酵条件进行初步摸索，采用单因素及正交试验，确定了最优的发酵条件:发酵温度为30℃;发酵时间为2 d;料水比为1∶5。经过验证，在此条件下得到的发酵液，其抗褐变效果最好，3 mL发酵液对马铃薯PPO的抑制率高达95.21%。

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Study on the Browning－Prevention of Potato Slurry by Pea Fermentation Liquid

Xu Han Zhou LiHua HanweiWang Qingzhang
(Institute of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070)

To find alternative methods for the control of browning，the experiment was designed to prevent the browning and polyphenol oxidase activity in potato slurry by pea fermentation liquid and its anti－browning mechanism and fermentation conditions was preliminary explored.The results showed that the pea fermentation liquid had better anti－browning effect of potato slurry;and it could inhibit browning because it could inhibit the activity of polyphenol oxidase;organic acid was not the main factors to inhibit browning.The single factor and orthogonal experiments determined the optimum conditions of pea natural fermentation:fermentation time of two days，fermentation temperature of 30 ℃，and material water ratio was 1∶5.It proved that the PPO inhibitory rate of fermentation liquid was 95.21%under the optimum conditions.

pea，natural fermentation，browning，polyphenol oxidase(PPO)

TS255.1

A

1003－0174(2012)09－0035－05

国家自然科学基金项目(31071619)

2011－12－06

徐涵，男，1985年出生，硕士，农产品加工及贮藏