槲皮素包合物微球的制备及其体外释放研究Δ

胡英，孙宝莹，高珊

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波3 1 5 1 0 0；2.济南市中心医院神内科，济南2 5 0 0 1 3）

槲皮素包合物微球的制备及其体外释放研究Δ

胡英1＊，孙宝莹2，高珊1

（1.浙江医药高等专科学校，浙江宁波3 1 5 1 0 0；2.济南市中心医院神内科，济南2 5 0 0 1 3）

目的：制备槲皮素β-环糊精包合物-壳聚糖微球（QT-CD-CM），并考察其理化性质和药物体外释放性能。方法：采用有机溶剂挥发法制备槲皮素β-环糊精包合物，再用乳化分散-离子交联法、以三聚磷酸钠为交联剂制备壳聚糖微球，并考察其形态、粒径、包封率、载药量和体外释放情况。结果：制备的QT-CD-CM形态规则、均质、无粘连，平均粒径（3.3 2 7±0.1 2 4）μm，包封率为3 2.4%，载药量为1 2.3%，在5%乙醇-磷酸盐缓冲液介质中7 2h可以达到完全释药，释药过程符合一级动力学模型。结论：QT-CD-CM理化性质及体外释药性能良好，制备工艺简单，有望成为理想的槲皮素给药系统。

槲皮素；包合物；壳聚糖；微球；制备；体外释放

槲皮素（Quercetin，QT）及其衍生物是自然界分布最广的黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗过敏、抗菌、抗病毒、抗癌等多方面的药理作用[1]。由于QT不溶于水，且油水分配系数小，难以通过胃肠道黏膜吸收，故生物利用度低，至今尚无一种较有效的制剂应用于临床。将难溶性的药物包合后可增加其溶解度[2]，从而提高溶出度和生物利用度，降低刺激性和不良反应[3]，其中β-环糊精（β-CYD）是良好的天然包合材料。以微球作为微粒给药系统的研究已相对深入，但主要涉及水溶性药物控释或缓释方面，由于难溶性药物存在释药不完全的问题，对其研究相对较少。

本试验将难溶性药物QT先形成包合物，再在此基础上制成微球，并研究该包合物微球的理化性能及体外释药行为。其中，选择壳聚糖（CS）作为微球材料，因其是一种天然、可生物降解的高分子阳离子聚合物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性[4]，已被广泛应用作微球材料。

1 仪器与试药

1.1 仪器

U3 0 0 0型高效液相色谱（HPLC）仪（美国戴安公司）；CRY-2 P差热分析仪（上海天平仪器厂）；XL3 0扫描电镜（荷兰Philips公司）；XSZ-3显微镜（北京市科仪电光仪器厂）；Zetasizer Nano激光衍射粒度分析仪（英国马尔文仪器有限公司）；AL2 0 4型电子天平（梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司）。

1.2 试药

QT原料药（山西慧科植物开发有限公司，批号：1 0 1 1 1 8，纯度：＞9 8%）；QT对照品（美国Sigma公司，批号：1 1 3 k1 0 5 1，纯度：＞9 9%）；CS（玉环海洋生化有限公司，分子量：8 0 0 0 0，去乙酰度：8 5%）；β-CYD（上海源聚生物科技有限公司，批号：1 0 0 6 2 1）；甲醇为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

透析袋（上海蓝季科技发展有限公司，分子量：1万～1.4万）。

2 方法与结果

2.1 QT包合物（QT-CD）的制备

采用有机溶剂挥发法[5]。称取约0.5 6 8 5 g的β-CYD溶于1 0 mL水中达到饱和，再加入用适量乙醇溶解的约0.1 8 g QT，有机溶剂挥发后，在6 0℃下，磁力搅拌4 h，即得。

2.2 空白微球（CM）的制备

采用乳化分散-离子交联法制备微球[6]。取CS（2%）-醋酸（2%）溶液9 mL，以水-油比1∶3（V/V）量取混合溶液，加至体积分数为1%吐温8 0和4%司盘8 0的液体石蜡2 7 mL中，室温下搅拌0.5 h，得到W/O型乳液。按照NH2-多聚磷酸钠（TPP）＝1.5∶1（摩尔比）的比例，滴入质量分数为8%的TPP溶液6 mL，继续搅拌1.5h。依次用适量的石油醚、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）、丙酮洗涤，抽滤，真空干燥，备用。

2.3 载药QT微球（QT-CM）的制备

按照QT-CS＝1∶1（质量比）的药载比先将约0.1 8 g QT用乙醇溶解后，再加入到CS（2%）-醋酸（2%）溶液9 mL中，搅拌1 5 min，静置得到QT-CS混合溶液，再采用“2.2”项下方法制备微球。

2.4 载药QT包合物微球（QT-CD-CM）的制备

按照QT-CS＝1∶1（质量比）的药载比将QT-CD加入到CS（2%）-醋酸（2%）溶液9 mL中，搅拌1 5 min，静置得到QT-CDCS混合溶液，再采用“2.2”项下方法制备微球。

2.5 微球载药量和包封率的测定[6]

称取微球适量，在研钵中研碎，用适量无水乙醇浸泡，超声1 h，3 7℃恒温振荡2 4 h，取上清液用适量5 0%乙醇稀释使QT完全溶出，离心后经0.4 5μm滤膜过滤得澄清的溶液，用HPLC法在3 7 3 nm波长测定其峰面积（A），代入“2.7.3”项下回归方程计算出浓度（c），求得QT的含量及包封率：载药量＝（微球内药物质量/微球的总质量）×1 0 0%；包封率（%）＝（系统中药物总量－游离药物量）/系统中药物总量×1 0 0%。结果QT-CM、QT-CD-CM包封率分别为6.5%、3 2.4%，载药量分别为9.3%、1 2.3%，后者明显更高。可见QT形成包合物后增加了药物的溶解度，易被包裹于CM中。

2.6 微球的形态及粒径观察

2.6.1 CM及QT-CD-CM的形态。用显微镜初步观察2种微球的外观形态，通过电镜进一步观察其表面形态和结构。2种微球的形态图见图1。

图1 2种微球的形态图Fig 1 Morphology of 2kinds of microspheres

由图1可见，显微镜下微球形态完整，表面光滑，呈类球形，粒子形状较规则，大小较为均匀，无粘连。电镜下微球表面呈一定的皱折状，CM表面多孔且凹陷；QT-CD-CM表面孔略小，但凹陷更明显。

2.6.2 3种微球的粒径及分布。用激光衍射粒度分析仪测得CM、QT-CM、QT-CD-CM 3种微球的粒径及分布情况，三者的粒径分别为（3.2 1 4±0.0 5 6）、（3.2 9 6±0.1 1 8）、（3.3 2 7±0.1 2 4）μm，多分散指数（PDI）分别为0.1 3 2、0.1 4 1、0.1 9 2。

2.7 体外释药

2.7.1 QT的含量测定[2]。色谱条件：色谱柱为Hypersil BDSC18（2 5 0mm×4.6mm，5μm），流动相为甲醇-磷酸盐缓冲液（PBS）（6 0∶4 0，PBS由4mL H3PO4+2mL三乙胺+1L的水组成），流速为1 mL·min－1，检测波长为3 7 3 nm，进样量为1 0 μL，柱温为3 0℃。理论板数按QT峰计不低于3 0 0 0。

2.7.2 溶液的制备。取QT对照品约1 7.5 mg，精密称定，置于1 0 0 mL量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀，得1 7 5 μg·mL－1的对照品溶液。精密称取QT-CD-CM和QT-CM适量，置于1 0 0 mL量瓶中，用流动相溶解并定容，摇匀，过滤，取续滤液适量，用流动相分别制备成1 7 5 μg·mL－1的溶液作为供试品溶液。

2.7.3 标准曲线的建立[2]。精密吸取对照品溶液1、2、4、8、1 0 mL，分别置于2 5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，使成7、1 4、2 8、5 6、7 0 μg·mL－1的溶液。用0.4 5 μm滤膜过滤得澄清溶液，取样分析，记录色谱图。以浓度（c）为横坐标，相应峰面积（A）为纵坐标，进行线性回归，得方程：A＝1.4 2 7 c+0.0 2 0（r＝0.9 9 9 9 8），表明QT检测浓度线性范围为7～7 0 μg·mL－1。

2.7.4 精密度、重复性、稳定性和回收率试验。根据相关方法学要求进行考察。（1）精密度试验：对照品溶液连续测定6次的RSD＝0.1 3%。（2）重复性试验：分别取3批QT-CM、QT-CDCM样品，制备成供试品溶液各3份，结果QT-CM供试品中QT含量的RSD分别为1.1 2%、1.4 3%、2.1 1%，QT-CD-CM供试品中QT含量的RSD分别为2.1 2%、0.9 8%、1.6 7%。（3）稳定性试验：2种供试品室温下放置，于1 2 h内每隔2 h测定1次，结果QT-CM供试品中QT含量的RSD＝1.3 6%，QT-CD-CM供试品中QT含量的RSD＝2.1 0%。表明在测定条件下，QT在2种微球中1 2h内均稳定。（4）回收率试验：精密称取对应处方量8 0%、1 0 0%、1 2 0%的QT对照品，分别加至QT-CM和QT-CDCM对应处方量的辅料中，制得高、中、低浓度的回收率试验溶液，分别测定3次。结果平均回收率分别为9 7.9%和9 9.1%，RSD分别为1.2 5%和2.1 7%。

2.7.5 载药QT体外释药试验。根据预试验，分别精密称取QT含量相同的QT-CM、QT-CD-CM适量，分别置于透析袋中，两端紧扎。将其置于2 5mL释放介质（5%乙醇-PBS（pH＝5.3））中 ，每种样品试验3次，平行对照，将其置于（3 7±0.5）℃水浴振荡器中，振荡频率为1 0 0次/min，于0.5、1、3、6、1 2、2 4、4 8、7 2、9 6、1 4 4、1 8 0 h时间点各取样1 mL，同时补充同温度的新鲜介质1 mL。样品经0.4 5 μm滤膜过滤后，HPLC法测定，计算其累积释放率，结果见图2。

图2 2种载药微球的体外累积释放曲线Fig 2 Drug release curves of 2kinds of drug-loaded microspheres in vitro

由图2可见，QT-CD-CM释放速度较快，在7 2 h左右就可以释放完全。将累积释放率与时间进行线性回归后[5]，得到QT-CD-CM的释放速率为1.7 9 92h－1，而QT-CM的释放速率为0.7 7 5 9 h－1，前者释放速率明显更快。

2.7.6 体外释药模型的拟合。采用常用药物释放模型即一级动力学方程、Higuchi方程、Weilbull方程对QT-CM、QT-CDCM释药数据进行拟合，结果见表1。

表1QT-CM、QT-CD-CM体外释药模型拟合结果Tab 1 Fitted drug release model of QT-CM and QT-CD-CM in vitro

由表1结果表明，QT-CM的体外释药更符合Weilbull动力学方程，QT-CD-CM体外释药更符合一级动力学方程。

3 讨论

CS是一种氨基葡糖与N-乙酰葡糖胺的共聚物，是迄今发现的唯一的天然碱性多糖，具有良好的组织相容性和体内降解性，故作为药物载体有着极大的前景。但对于难溶性药物，CS作为微球材料所得微球的载药量和包封率均较低，但经CYD包合后再形成微球可提高药物的包封率和载药量，从而改变药物的释放性能[5]。

微球的粒径取决于CS溶液的浓度、乳剂的稳定性、搅拌速度、固化剂的种类等，其中搅拌速度、表面活性剂用量对该微球粒径的影响较大[7]。本试验在微球制备过程中选择表面活性剂占外相比为5%（1%吐温8 0和4%司盘8 0），此时制备的微球外观形态圆整，粒径大小均匀，粒度分布范围窄。

从本试验结果可见，2种载药微球（QT-CM、QT-CD-CM）的粒径改变不大，但药物的释药性能改变比较大，可以认为难溶性药物经过包合作用后再制成微球，可以提高其释药性能，因此本文对槲皮素制剂的开发应用具有一定的意义。

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Study on the Preparation of Quercetin Inclusion Complex Microsphere and Its Drug Release in Vitro

HU Ying，GAO Shan（Zhejiang Pharmaceutical College，Zhejiang Ningbo 3 1 5 1 0 0，China）
SUN Bao-ying（Dept.of Neurology，Jinan Central Hospital，Jinan 2 5 0 0 1 3，China）

OBJECTIVE：To prepare Quercetin-β-cyclodextrin inclusion complex-chitosan microspheres（QT-CD-CM），and to investigate their physiochemical property and release characteristics in vitro.METHODS：The quercetin-β-cyclodextrin inclusion complexes were prepared by organic solvent evaporation methods，and then formed chitosan microspheres which were prepared using emulsion-linking technique with sodium tripolyphosphate as the cross-linker.The morphology，particle size，encapsulation efficiency，drug-loading amount and release kinetics of microspheres were investigated.RESULTS：Prepared QT-CD-CM were regular，discrete and uniform spheres with mean particle size of（3.3 2 7±0.1 2 4）μm，encapsulation efficiency of 3 2.4%and drug-loading amount of 1 2.3%.Prepared microspheres released completely in 5%ethanol-PBS in 7 2h，which was in line with first-order kinetic model.CONCLUSION：QT-CD-CM are sound in physicochemical and release property and simple in preparation technology，and can be used as ideal drug delivery system for quercetin.

Quercetin；Inclusion complex；Chitosan；Microsphere；Preparation；In vitro release

R9 4 3

A

1 0 0 1-0 4 0 8（2 0 1 2）3 3-3 1 0 5-0 3

DOI1 0.6 0 3 9/j.issn.1 0 0 1-0 4 0 8.2 0 1 2.3 3.1 3

2 0 1 1-0 9-0 2

2 0 1 2-0 3-2 8）