一次微生物混合考核盲样检测分析

付冬莲，袁国辉，赖玉珍，周 丽

(南昌市青云谱区疾病预防控制中心,江西 南昌330006)

近期,江西省技术质量监督局受理了我疾控中心提出的实验室资质认定和食品检验机构资质认定二合一的申请，并向我疾控中心检验科发放了微生物考核盲样,以此来综合检测实验室仪器设备的性能、实验试剂的质量及技术人员操作能力,此次考核有益于提高检验人员的业务素质和实验室的检测能力[1]。现将我中心检验科的盲样考核结果及检验过程报道如下。

1 材料与方法

1.1 标本来源 由江西省疾病预防控制中心发放的混合菌盲样(编号为03号,螺旋小试管内装脑心浸液肉汤,要求5个工作日内报告盲样中的病原菌)。

1.2 培养基 、试剂 培养基及生化反应管均由青岛高科园海博生物技术有限公司提供;API20E、API Listeria均购自法国梅里埃(上海)生物有限公司，均在有效期内,培养基均经过质量控制，符合质量要求才使用。

1.3 诊断血清 沙门菌诊断血清和志贺菌诊断血清:宁波天润生物药业有限公司生产;均在有效期内。

1.4 检验方法 中华人民共和国国家标准GB/T4789-2003、GB/T4789-2008、GB4789-2010、GB4789-2012

2 检验方法与步骤

2.1 直接分离培养 (以下实验中所采用的培养温度均为 36℃，20h，但MYP为30℃48 h)拿到混合菌盲样时，观察菌种管有无破损 ，及时进行菌种的分离与鉴定，无菌操作，打开菌种管，首先进行涂片做革兰染色镜检，革兰染色镜检结果是革兰无芽胞阳性短杆菌和革兰阴性无芽胞杆菌 ；根据革兰染色镜检的结果，选用相应的培养基：营养琼脂、血琼脂、SS、XLD、4 号琼脂、TCBS 琼脂、BPK、MYP、沙门菌显色培养基、志贺菌显色培养基、O157显色培养基、李斯特菌显色培养基、阪崎肠杆菌显色培养基，经过16h、36℃培养后观察结果(其中BPK琼脂、李斯特菌显色培养基需48h才能观察结果)。

2.2 纯培养 (1)观察经选择性琼脂平板直接分离培养的菌落特征，SS琼脂平板上有两种菌落 ：一种无色半透明，圆形，菌落中心带黑色，另一种为无色半透明菌落；XLD琼脂平板上有两种菌落：一种为粉红色，菌落中心呈现大的黑色中心，另一种为粉红色菌落；沙门菌显色培养基平板：一种紫色圆形中等大小菌落，一种白色小菌落；志贺菌显色培养基：一种为黑色几乎占满整个菌落，边缘为无色的菌落；一种为中心为淡蓝色，边缘为无色的菌落；营养琼脂：一种为无色中等大小的菌落，一种为稍大些，呈梨型无色菌落；一种为无色稍小的带黏性，接种环不易挑取的菌落；血琼脂平板上有三种菌落：一种为灰白色，中等大小，不透明；一种为灰白色，稍大些，不透明，表面光滑；另一种灰白色，中等大小，不透明,有狭窄溶血环；挑取营养琼脂、血琼脂、SS、XLD、沙门菌显色培养基、志贺菌显色培养基上的生长的可疑菌落分别接种于三糖铁斜面及赖氨酸脱羧酶生化管；其余4号琼脂、TCBS琼脂、BPK、MYP、O157显色培养基、阪崎肠杆菌显色培养基均未生长出与选择培养基对应的可疑菌落。(2)挑取在单核细胞增生李斯特菌显色培养基培养48h的浅蓝色的带晕轮样落菌落接种于木糖、鼠李糖生化管，同时于TSA-YE平板纯化。

2.3 进一步生化反应 (1)三糖铁斜面36℃、20h观察形成两种结果:①革兰阴性直杆菌，无芽胞，无荚膜:K/AG,底部为黑色；赖氨酸脱羧酶阳性;②革兰阴性短杆菌，无芽胞，无荚膜：K/A，底部为黄色；赖氨酸脱羧酶阴性；挑取①的纯培养物做靛基质、pH7.2尿素、氰化钾三项生化；同时挑取①及②纯培养物分别接种API20E生化试剂盒。(2)选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物进行革兰染色、动力、溶血试验，同时接种API Listeria生化试剂盒。

2.4 生化反应及结果 (1)上述①经API20E生化试验，生化反应显示ONPG-ADH+LDC+ODC+CIT+H2S+URE-TDA-IND-VP-GEI-GLU+MAN-INOSOR+RHA-SAC-MEL+AMY-ARA-OX-,结果判定为沙门菌属(79.0%id，用血清学试验确证)；观察靛基质、pH7.2尿素、氰化钾三项生化，全部为阴性；上述②经API20E生化试验，生化反应显示ONPG+ADH-LDC-ODC+CIT-H2S-URE-TDAIND-VP-GEI-GLU+MAN+INO-SOR-RHA+SACMEL-AMY-ARA+OX-结果判定为志贺菌属(89.0%id，用血清学试验确证)；同时补做三项生化葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐、黏液酸盐，均为阴性。(2)上述木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物革兰染色为革兰阳性短杆菌，用生理盐水制成菌悬液，在油镜下观察，该菌出现翻滚样的运动；在SIM动力培养基呈月牙状生长；在羊血琼脂平板上刺种周围产生狭小的透明溶血环；APIListeria生化反应结果具体见表1,查李斯特菌数码图谱(2510)提示为单核细胞增生李斯特菌。

表1 API Listeria生化反应结果

2.5 血清学分型 取上 述①的纯培养物与沙门菌属诊断血清中的 A～F多价O血清及单因子血清做玻片凝集试验 ,同时用生理盐水做对照,血清学分型鉴定结果为肠炎沙门氏菌(1,9,12,g,m);取上 述②的纯培养物与志贺菌属诊断血清中的四种多价血清及分型血清做玻片凝集试验 ，同时用生理盐水做对照 ，血清学分型结果为宋内志贺菌I型 ，同时用宋内志贺菌标准菌株做比对,比对结果一致。

3 鉴定结果

综合以上菌落形态、染色镜检、生化试验 、血清学分型试验结果,报告盲样03号脑心浸液肉汤混合菌样品检出肠炎沙门菌和宋内志贺菌I型以及单核细胞增生李斯特菌。实验结果与省疾控中心的结果完全符合。

4 讨论

4.1 本次微生物考核盲样分离培养首先采用海博显色培养基，在显色培养基上生长的紫色的沙门菌菌落、白色的志贺菌落、蓝色的单核细胞增生李斯特菌落特征明显,颜色分明，易于判读和挑取，可以防止漏检，同时简化了检测步骤，针对性更强。

4.2 考核盲样往往是2～3株菌株接种于同一样本中,而考核者接种时又特意加大某种或减少某种菌株的量,制造一定的难度,此次考核样中沙门菌为优势菌，在SS、XLD、营养琼脂血琼脂、沙门菌及志贺菌显色培养基上的菌落生长远远覆盖了整个平皿，稍不留意，志贺菌落很难被发现，但因我们平时工作中多加注意识别,不同细菌菌落之间还是有一定区别的,故被考核者必须严格遵守相关标准,认真操作,不可操之过急,注意把握好增菌,分离,培养的时间,将考核工作与平时工作结合起来,把好各个环节,与平时摸索出的一些微生物生长的特点有机运用起来,使样品中非优势菌也能被检出[2]。

4.3 在志贺菌的补充微量生化反应中,我们发现,葡萄糖铵、西蒙氏柠檬酸盐的试验应在规定的48h内看结果，同时要注意掌握接种生化管的菌量要适量，否则会出现判断失误。

细菌检验质量控制直接关系到细菌学检测结果的准确性和可靠性,是卫生监测不可缺少的部分。参加微生物盲样考核,有利于督促和提高检验人员的专业检测水平,增加检验结果的可靠性和正确性[3]。

[1]纪 静.一次微生物实验室室间比对的报告和体会[J].实验与检验医学,2011,29(3):275-276.

[2]李苏英.盲样菌株微生物室间质控考核分析[J].浙江预防医学,2006,18(1):3.

[3]陈文胜,刘礼怦,罗建波,等.卫生微生物实验室间质量评价的探讨[J].中国卫生检验杂志,2004,14(5):624-625.