焦磷酸测序技术检测耐多药结核分枝杆菌

朱长太，郑瑞娟，王 洁，胡忠义

(同济大学附属上海市肺科医院，上海200433)

近年来随着，耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)的出现和蔓延，使得结核防控更加困难[1,2]。建立可靠的结核耐药检测方法对于结核病的治疗及防控无疑具有重要意义。由此，本文旨在建立一种结核分枝杆菌菌株耐多药快速检测方法，并评价其在临床应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 202株被BACTEC 960药敏证实为MDR-TB临床分离株为上海市肺科医院2010年至2011年临床确诊的肺结核患者的痰标本培养阳性菌株。

1.1.2 主要仪器 PSQ96全自动焦磷酸测序仪 (瑞典Biotage公司)、基因扩增仪 (德国Eppendorf公司)、BACTEC MGIT 960检测仪 (美国 Dickinson公司)、Gene Genius全自动凝胶成像分析系统 (英国Syngene 公司)。

1.1.3 主要试剂 焦磷酸测序试剂盒、链亲和素包被的磁珠均为瑞典PYROSEQUENCING AB公司产品，Bactec 960试剂购自美国Dickinson公司，Taq酶等PCR扩增体系试剂均为大连宝生物工程有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取保存于改良罗氏培养基的结核分枝杆菌，接种于Middlebrook 7H9液体培养基，37℃培养2～3周后取1.0 ml液体培养物，80℃水浴保温30 min灭活菌株，10 000 r/min，离心10 min弃上清，双蒸水洗涤沉淀后将菌体沉淀重悬于 50μl裂解液中，50℃水浴 1 h，沸水浴 10 min，离心去上清。

1.2.2 引物设计与PCR扩增 使用PSQ96MA系统自带软件Pyrosequencing TM Assay Design软件，设计rpoB、katG基因PCR扩增引物和焦磷酸测序引物，设计的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。各耐药基因PCR反应体系为50μl：基因组模板2.0μl，4种脱氧核苷三磷酸的终浓度各为0.2 mmol/L，上、下游引物的终浓度各为0.4μmol/L，Taq DNA聚合酶1.0 U。PCR反应循环参数除退火温度为：95℃预变性5 min；94℃30 s，72℃ 30 s，共 50个循环，72℃延伸 10 min。PCR产物固定后，纯化单链模板，进行焦磷酸测序。运用Identifire分析软件，将测序所得序列与MTB标准菌株耐药基因序列进行比对，确定结核杆菌临床分离株各基因的突变类型和突变位置。

1.2.3 统计学分析 应用SPSS 13.0软件进行数据处理，计算焦磷酸测序技术检测MDR-TB的灵敏度及特异度。

1.2.4 质量控制 MTB标准菌株(H37Rv,ATCC27294)为本研究的质控株。

2 结果

本研究中，我们确定表1中DNA序列作为rpoB、katG基因PCR扩增引物和焦磷酸测序引物来检测结核菌利福平及异烟肼耐药性。我们以焦磷酸测序同时检测到rpoB基因及katG基因突变判读为MDR-TB，结果显示：202株结核分枝杆菌临床分离株中，焦磷酸测序检测到MDR-TB共计154株；以BACTEC MGIT 960检测结果为判读标准，则焦磷酸测序法检测MDR灵敏度为72.8%[95%可信区间 (confidence interval:CI):66.3%～78.4%]，特异度为 90.0%(95%CI:80.1～95.1%)。 耐多药结核分枝杆菌焦磷酸测序检测结果表2。

表1 rpoB、katG基因PCR扩增引物和焦磷酸测序引物

表2 耐多药结核分枝杆菌焦磷酸测序检测结果

3 讨论

结核病耐药是目前全球关注的一个公共卫生问题，已严重威胁到人类的健康。目前结核耐药检测常规方法多采用细菌学药敏方法，该方法所需时间长，不能及时为临床提供用药指导。焦磷酸测序技术是一种新近发明的以检测DNA合成过程中所产生的焦磷酸为基础的实时DNA测序技术[3,4]。焦磷酸测序技术实际上依靠四种酶(DNA聚合酶、三磷酸腺苷硫酸化酶、萤光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶)及两种底物(APS和荧光素)完成。与Sanger法不同，焦磷酸测序技术依赖于核苷酸掺入中焦磷酸盐的释放，而非双脱氧核苷三磷酸参与的链终止反应[5]。目前，焦磷酸测序技术已被广泛应用于病原微生物快速鉴定、病毒与细菌分型、突变检测及药物基因组学等各个方面[6-9]。

本研究我们建立焦磷酸测序检测异烟肼、利福平药物耐药性方法，BACTEC 960法以利福平及异烟肼同时耐药判读为MDR，而焦磷酸测序法以同时检测到rpoB基因及katG基因突变判读为MDR。在202株结核分枝杆菌临床分离株中，焦磷酸测序检测到MDR-TB共计154株。以BACTEC960检测结果为判读标准，焦磷酸测序法检测MDR灵敏度为72.8%(95%CI:66.3%～78.4%)， 特异度为 90.0%(95%CI:80.1%～95.1%)。从研究结果来看，新确立的焦磷酸测序技术可检测结核分枝杆菌对利福平、异烟肼的耐药性，具有较高的特异性与灵敏度。与Sanger法相比，焦磷酸测序技术具有高通量、低成本、检测报告时间更短等优势[9]，由此我们认为新建立的焦磷酸测序技术可作为耐多药结核分枝杆菌药敏实用的检测工具，值得临床推广应用。

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