优化高氏Ⅰ号培养基在泰乐菌素菌种培养中的应用

张 丽，张 萍，石彦鹏，马 燕

(宁夏泰瑞制药股份有限公司菌种研究所，银川 750101)

泰乐菌素(Tylosin)是由弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)产生的一类大环内酯禽畜专用抗生素。广泛应用于畜禽支原体疾病，细菌性疾病及螺旋体病和寄生虫病的防治。特别是其强烈的抗支原体特性，使其成为治疗畜禽支原体病的首选药物，而且对禽、畜的生长有明显促进作用，并且不残留［1］。被国内外广泛用作为饲料添加剂，是国家规划重点发展的兽药产品［2］。

在现有的泰乐菌素生产中，所用的斜面培养基多为麸皮培养基，而麸皮的质量、品种的变化以及制作时不易掌握、甚至在每次配制时的煮沸、过滤等人为操作差异都会影响到斜面配比的稳定。经典的用于培养放线菌的高氏I号斜面培养基在斜面培养基配制中虽然质量容易控制，较稳定，但是斜面孢子生长需14～15 d，周期长，不太适合大规模生产。本文在原有高氏I号培养基配方中加入豆饼粉和酵母浸膏粉，通过单因子实验和正交试验设计［3］对斜面配方进行优化，能够兼具麸皮斜面生长快的优势，在生产中得到良好的应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种 泰乐菌素产生菌 TLⅡ10-1222#由宁夏泰瑞制药股份有限公司提供。

1.1.2 试剂及原料［4］麸皮(取本地产红皮小麦自制)，氯化钴(天津市风船化学试剂科技有限公司)，硫酸亚铁、硫酸锌、氯化镁、氯化钠、磷酸氢二钾、硝酸钾、硫酸镁(均为天津市凯通化学试剂有限公司)，鱼蛋白胨、酵母膏(北京奥博星生物技术有限公司)，酵母膏粉(英国进口)，玉米淀粉(通良万顺达生物科技有限公司)泰乐菌素标准品(中国兽药监察所)，玉米浆(华北康欣)，豆饼粉(中宁县天合工贸有限公司)，鱼粉(吴忠玉环有限公司)，玉米粉(宁夏泰瑞制药股份有限公司)，玉米蛋白粉(内蒙阜丰)，氯化钾(俄罗斯)，硫酸镍(陵县汇丰钴业)，盐酸甜菜碱(潍坊祥维斯化学品有限公司)，磷酸氢二铵(什邡市百盛化工有限公司)，碳酸钙(永登天玉化工有限公司)。

1.1.3 仪器与设备 旋转摇瓶机，型号XDW25/96，四川长征制药机械厂;紫外可见分光光度计，型号752N，上海精密科学仪器有限公司;恒温恒湿控制系统，型号BUH-03B/BUH-03A，苏州市北冰洋空调设备有限公司、净化工作台，型号YJ-HS-2，无锡市荣丰净化空调设备厂。

1.2 方法

1.2.1 培养基

1.2.1.1 斜面培养基的制备:麸皮斜面培养基的制备，参见宁夏泰瑞制药股份有限公司企业内控标准。将麸皮用纯化水煮沸30 min，过滤取汁，加入鱼蛋白胨、氯化钴、硫酸亚铁、氯化镁、硫酸锌、琼脂用纯化水溶解后定容到所需体积，调pH为7.80～8.00，分装于250 mL 茄瓶中，120 ℃灭菌30 min，冷却至不烫手时铺成斜面，凝固后，孵至表面无游离水。高氏I号斜面培养基的制备，将玉米淀粉用纯化水溶解，加热，糊化后，加入硝酸钾、硫酸亚铁、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、酵母膏粉、豆饼粉、琼脂用纯化水溶解后定容到所需体积，调pH为7.20～7.40，分装于 250 mL 茄瓶中，在 120 ℃、0.11MPa下灭菌30 min，冷却至约50℃铺成斜面，凝固后，孵至表面无游离水。

1.2.1.2 种子瓶培养基、发酵瓶培养基制备参见参考文献［4］。

1.2.2 接种培养 取沙土管保藏的生产菌种适量，加生理盐水制备成孢子悬浮液，用玻璃棒蘸取菌悬液在茄瓶内连续划线，均匀密集地涂满整个斜面。每种培养基各接斜面10瓶，置于恒温室中培养，按照宁夏泰瑞制药股份有限公司企业内控标准规定的条件分别培养至 7、8、9、10、11 d，分别观察斜面孢子成熟度。

1.2.3 实验方法

1.2.3.1 在高氏I号斜面培养基中分别添加豆饼粉、酵母膏粉、玉米浆进行单因子实验。

1.2.3.2 结合单因素实验结果对高氏I号斜面培养基基础配方中添加的酵母膏粉、豆饼粉及斜面孢子培养周期采用正交设计L25(56)的进行优化。

2 结果与分析

2.1 在高氏I号培养基(对照组)中分别添加不同比例的豆饼粉、酵母膏粉和玉米浆，并与高氏I号、麸皮培养基斜面孢子同期对比，以发酵摇瓶酸化液的化学效价为数据测定标准，其实验数据如下表1。

表1 豆饼粉、酵母膏粉和玉米浆加量在高氏培养基配方中的摇瓶效价

对比各实验组结果及t值，带*组即添加玉米浆各实验组和高氏I号斜面组的平均效价低于麸皮斜面组，且t值均大于t界值表中相应的 t值2.776 (α =0.05，t0.05/2，4)，其差异具有显著性，可认为添加玉米浆不利于泰乐菌素菌种培养，故在后续添加实验中舍去玉米浆各组。对豆饼粉和酵母膏粉的添加剂量和培养周期进行正交设计，以确定最佳组合。

2.2 对高氏I号斜面培养基基础配方中添加不同比例的豆饼粉(A)、酵母膏粉(B)及斜面孢子培养周期(C)按正交设计L25(56)进行优化，正交设计表如表2。正交实验结果如表3。

表2 因素水平表

表3 正交实验结果

表3的实验结果表明，19号实验摇瓶效价最高，平均达到13959 u/mL，豆饼粉对摇瓶效价的影响比较大，为主要因子。通过直观分析得出，斜面孢子培养基最优配方和最佳培养周期为:A4B2C3，高氏I号培养基在基础配方中添加1.0%豆饼粉和0.2%酵母膏粉，斜面培养至9 d效价最高，斜面孢子生长均匀，压片镜检孢子量大，大部分成游离孢子。

2.3 在培养至第9 d，分别对麸皮斜面和优化后的高氏I号培养基上的菌种进行压片，经美兰染色后进行显微镜观察(放大倍数:1000×)，发现在优化后的高氏I号培养基上菌种成熟度明显好于麸皮培养基，产生了大量的游离单孢子和链状孢子，而麸皮培养基上仍为气生菌丝。如图1。

图1 两种培养基上菌种压片镜检图

3 讨论

在高氏I号培养基基础配方中添加1.0%豆饼粉和0.2%酵母膏粉，能够明显改善原高氏I号培养基生长慢的现象，使斜面生长周期缩短至9 d，产生大量优质的孢子，够达到麸皮培养基的菌体生长的速度，而且摇瓶效价高于麸皮培养基斜面。同时其制备过程中简单，原材料质量容易控制，有利于生产的稳定。优化后的高氏I号培养基完全可替代麸皮培养基用于生产。

［1］田国泰.泰乐菌素在畜禽业上的应用［N］.中国畜牧水产报，2001-03-04:第7版.

［2］史小丽.泰乐菌素的性能与应用［N］中国畜牧水产报，2001-09-30:第4版.

［3］ 张绍镛，严圣武，等.质量管理中的试验设计方法［M］.北京:北京理工大学出版社，1991:32-119.

［4］石彦鹏，张 丽，张 萍.硫酸亚铁对泰乐菌素发酵的影响［J］.中国兽药杂志［J］，2009，43(6):30-31.