高效液相色谱法测定乳房炎涂膜剂中咖啡酸的含量

王小飞，李继昌，孙 博，王凤霞，代重山，孙美成

(东北农业大学动物医学学院，哈尔滨 150030)

乳房炎涂膜剂是本实验室自行研制的中药制剂。本品由蒲公英、紫花地丁等十种中药组成，具有清热解毒、活血散瘀、消肿散痈、排脓通络之功效，主治乳痈初期、红肿热痛、痈疽黄肿，适用于奶牛、猪等家畜临床型、隐性型乳房炎及乳头炎、乳房肿块等病症，及化脓、蓄脓、乳房红肿热痛、机械性和吮吸性损伤引起的乳房皮温升高、乳汁不下等乳房疾病［1］。

蒲公英为方中君药，干燥品中蒲公英含量在15%以上，其活性成分主要为咖啡酸，故选用咖啡酸为含量指标，采用HPLC法对乳房炎涂膜剂进行质量控制。此方法操作简单、结果准确、专属性好。

1 仪器、材料与试药

1.1 仪器 Waters高效液相色谱仪系统，515双泵，2998光二极管阵列检测器，7725Ⅰ进样阀，Empower中文色谱工作站;KQ-100 E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 材料与试药 咖啡酸对照品，中国食品药品检定研究院，批号:110885-200102;乳房炎涂膜剂，东北农业大学药理教研室自行研制;试验用水为超纯水;甲醇，色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司，冰醋酸，分析纯，哈尔滨市新达化工厂。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 Waters Symmetry shieldTMC18色谱柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 -1%冰醋酸溶液(20∶80)，体积流量为1.0 mL/min;检测波长为323 nm，进样量为10 μL，柱温为35℃。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备［2］精密称取咖啡酸标准品2 mg置于25 mL的容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀释至刻度，制成每毫升含80 μg的溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液［3］精确量取乳房炎涂膜剂10 mL，于50 mL容量瓶中，加甲醇40 mL，超声处理 20 min，放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.22 μm 的微孔滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取按处方量称取除蒲公英外阴性样品，按照供试品溶液项下的方法制成阴性样品溶液。

2.3 专属性考察 按上述色谱条件，分别对对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液进行分析，典型的色谱图见图1。结果表明，阴性对照品溶液中无咖啡酸吸收峰，咖啡酸与相邻峰的分离度均大于1.7，理论塔板数按咖啡酸计算不低于3000［4］。

图1 咖啡酸的HPLC色谱图

2.4 线性关系的考察 精密量取对照品溶液1、2、3、4、5 mL 于 10 mL 容量瓶中，甲醇定容后，得 8、16、24、32、40 μg/mL 的对照品溶液，用 0.22 μm 的滤膜过滤于进样小瓶中，分别进样10 μL，测峰面积，以峰面积对进样浓度进行回归，求得回归方程A=44509C-40187，r2=0.9989。表明咖啡酸在8～40 μg/mL范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 对同一份咖啡酸对照品溶液，连续重复进样6次，记录峰面积，计算RSD，结果为1.10%，表明该方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 取批号为120301的样品，制成供试品溶液，分别于 1、2、4、6、8、10、12、14、16 h 进样，记录咖啡酸的质量分数，计算得RSD为0.56%。表明供试品溶液在16 h内稳定。

2.7 重现性试验 取同一批样品(批号:120301)，平行制备6份供试品溶液，进样分析，记录咖啡酸的质量分数，其RSD为0.34%。

2.8 加样回收率试验 精密量取已测知咖啡酸质量浓度的乳房炎涂膜剂的供试品溶液6份，分别加入8.09、15.88 μg/mL 的咖啡标准品溶液，制备成供试品溶液，进样分析，计算加样回收率，结果如表1所示。

表1 咖啡酸加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取 3批样品(批号:120301、120302、120303)，制备成供试品溶液，进样分析，记录咖啡酸峰面积，外标法计算咖啡酸含量，结果如表2所示。

表2 样品中咖啡酸含量的测定结果(n=5)

3 讨论

目前HPLC法测定咖啡酸的含量使用的流动相为磷酸盐缓冲液。高效液相色谱的色谱柱与泵都是高精密度的分析部件，磷酸盐无论在甲醇还是乙腈中的溶解度都很小，因此在含磷酸盐的流动相体系中，容易有磷酸盐晶体析出，就会发生堵柱或堵泵的现象［5-6］。本方法使用冰醋酸为洗脱流动相，避免了对色谱柱及色谱系统的损害［7］。该方法能精确定量乳房炎涂膜剂中的咖啡酸含量，用上述方法测得的色谱图中咖啡酸峰的峰形较好，与其他组分均可达到基线分离、空白对照无干扰，该方法的精密度、稳定性、重现性、加样回收率试验均符合《中国药典》的相关规定，能有效控制乳房炎涂膜剂的咖啡酸含量。

［1］张秀英，王 新，刘芳萍，等.治疗奶牛乳房炎中药透皮软膏及其制备方法:中国，CN101342243［P］.2009-01-14.

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［6］章志青.含盐流动相损坏色谱柱原因分析［J］.四川化工，2009，12(5):41-43.

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