猪肺炎支原体和猪鼻支原体双重PCR检测方法的建立与应用

刘茂军，王占伟，韦艳娜，马庆红，杨莉莉，周勇岐，，邵国青

(1.江苏省农业科学院兽医研究所·农业部兽用生物制品工程技术重点实验室·国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014;2.南京天邦生物科技有限公司，南京 211102)

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)的主要病原，该病又称猪气喘病或猪地方流行性肺炎(EPP)，是一种猪的慢性呼吸道传染病，在全世界广泛存在，长期以来被认为是最常发生和经济意义重大的猪病之一。该病常继发或混合感染其他细菌性或病毒性疾病，引起猪呼吸道病综 合 征 (Porcine respiratory disease complex，PRDC)［1］。 猪 鼻 支 原 体 (Mycoplasma hyorhinis，Mhr)也是猪呼吸道病综合征的病原之一，并可引起多发性浆膜炎和多发性关节炎，临床上与副猪嗜血杆菌病易混淆，使鉴别诊断难度增大［1-3］。Mhr可通过滤器，在细胞培养过程中，Mhr是最主要和最常见的污染源之一，使细胞凋亡或者细胞活力下降，最终导致细胞废弃;Mhr易生长且生长快，常掩盖Mhp，导致 Mhp分离和培养失败［4-6］。目前，检测Mhp的常用方法有分离培养、微粒凝集、荧光抗体法、核酸探针法和PCR法。Mhr的检测方法报道较少，主要是分离培养和PCR等。Mhp的培养条件比Mhr要求苛刻，常被Mhr所掩盖。血清学检测方法两者之间存在交叉反应，难以区分，从而给Mhp的鉴别诊断带来了困难［7］。PCR法较其他方法敏感、快速，适宜于大批样品的检测以及流行病学的调查，目前两个病原都分别建立了普通PCR方法［8-9］。本文在先前研究的基础上，建立了Mhp和Mhr的双重PCR检测方法，为这两个病原的检测提供了快速、准确的方法。

1 材料

1.1 菌株和样品 Mhp、Mhr、絮状支原体(Mf)、鸡毒支原体(Mg)、副猪嗜血杆菌(HPs)、胸膜肺炎放线杆菌(App)、猪链球菌2型(SS-2)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)和蓝耳病病毒(PRRSV)为江苏省农业科学院兽医研究所保存。69批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)由南京天邦生物科技有限公司生产。120份MPS临床肺组织于2011年采集自南京某屠宰场。5份细胞样品来源于江苏省农业科学院兽医研究所。

1.2 试剂 PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR试剂购自TaKaRa公司。

2 方法

2.1 模板制备 按照参考文献的采样方法采样，采集待检猪肺脏的病变组织与健康组织交界部位，研磨、反复冻融、煮沸提取 DNA，作为模板，置于-20 ℃ 保存［8］。

2.2 引物设计 根据GenBank Mhp 16S rRNA基因(Y00149.1)和 Mhr 16S rRNA 基因(M24658.1)的序列设计引物，引物序列为:

以上引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 双重PCR方法的建立 PCR扩增体系为:10 × PCR Buffer(Mg2+Free)2 μL，25mmol/L MgCl21 μL，各 2.5 mmol/L dNTPs Mixture 2 μL，20 pmol/μL Mhp 引物 0.5 μL，20 pmol/μL Mhr引物0.5μL，20 pmol/μL MR 引物1 μL，模板 DNA 2 μL，5 U/μLTaq 酶 1 μL，加 ddH2O 至20 μL。反应条件为:95℃预变性5 min，94℃变性30 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，72℃终延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶在120 V电压下电泳鉴定。若出现1000 bp条带的样品，判为Mhp阳性;若出现1129 bp条带的样品，判为Mhr阳性。

2.4 PCR 的特异性试验 取 Mhp、Mhr、Mf、Mg、HPs、App、SS-2、CSFV、PCV2 和 PRRSV，获得基因组DNA或cDNA，同上体系进行PCR反应，来确定PCR的特异性。

2.5 PCR扩增的敏感性试验 Mhp和Mhr模板用紫外分光光度计测得浓度分别为3.3 μg/mL和2.9 μg/mL，然后进行一系列10倍梯度稀释到10-5，然后按照同上的PCR扩增体系和条件进行PCR，以检测此方法的敏感性。

2.6 样品检测 使用上述建立的双重PCR法对猪场采集肺组织120份、69批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)和5份疑似支原体污染细胞进行检测。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增结果 用Mhp和Mhr阳性样品作为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳结果表明，PCR成功地扩增出1000bp(Mhp)和1129bp(Mhr)大小的条带(图1)，与预期结果相符。

3.2 PCR 特异性实验结果 以 Mhp、Mhr、Mf、Mg、HPs、App、SS-2、CSFV、PCV2 和 PRRSV 的基因组DNA或cDNA为模板，利用已经建立的双重PCR进行检测。琼脂糖凝胶电泳结果如图2，Mhp和Mhr均扩增出目的条带，Mf、Mg、HPs、App、SS-2、CSFV、PCV2和PRRSV均未出现相应条带。

3.3 双重PCR的敏感性试验结果 将Mhp DNA模板(浓度为3.3 μg/mL)和 Mhr DNA 模板(浓度为2.9 μg/mL)进行一系列10倍梯度稀释，按照同上的PCR扩增体系和条件进行PCR，琼脂糖凝胶电泳结果如图3，显示Mhp和Mhr最低可从10-4倍稀释的模板中扩增到目的条带，说明该双重PCR的最低检出量 Mhp 为0.66 ng，Mhr为 0.58 ng。

图3 Mhp和Mhr的敏感性试验结果

3.4 样品的双重PCR检测结果 利用Mhp和Mhr双重PCR法检测120份临床猪肺可疑样品、69批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)和5份疑似支原体污染细胞。结果显示，临床样品中，28份是Mhp 阳性(23.3%)，17 份是 Mhr阳性(14.1%);69批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)全部为Mhp阳性，无Mhr污染;5份疑似支原体污染细胞全部为Mhr阳性。以上试验结果均与建立的 Mhp P36 PCR和Mhr P37 PCR［7-9］方法检测结果一致。部分琼脂糖凝胶电泳结果如图4。

图4 样品的双重PCR检测结果

4 讨论

近年来，猪病的发生多以混合感染出现，这在疾病的诊断上带来了困难。Mhp的感染常常是引起猪呼吸道病综合征发生的重要条件。在Mhp感染猪时，常伴有Mhr的感染，而Mhr感染猪的临床表现与HPs极其相似，且目前HPs发病率较高，易导致误判。目前的检测方法主要有分离培养、PCR、血清学等。由于Mhp较Mhr培养条件苛刻，在分离培养Mhp时常被Mhr所掩盖，给分离培养带来困难和错误。在血清学上Mhp与Mhr具有一定的交叉性，因此，血清学方法具有一定的假阳性。本研究利用16S rRNA在细菌种间的保守性，设计了3条针对Mhp和Mhr 16S rRNA基因的特异性引物，可特异性的扩增到Mhp和Mhr，这将为Mhp和Mhr的可疑病料以及Mhp和Mhr污染样本的检测提供了快速简便准确的方法。

本研究建立的Mhp和Mhr双重PCR法，经特异性试验证明，能特异性的检测出Mhp和Mhr，而与供试的其他病原均不反应。敏感性试验证明，该方法最低可以检测到0.66 ng的Mhp基因组DNA和0.58 ng的Mhr基因组DNA;目前报道了P36的敏感性为0.426 ng Mhp基因组 DNA，P46为0.5 ng Mhp基因组DNA，该方法与先前的报道相近［8-9］。因此，集高特异性和高敏感性于一体的Mhp和Mhr双重PCR法将在其检测和鉴别中发挥重要的作用。

猪支原体肺炎在大多数猪场长期存在，Mhp和Mhr是其主要病原。王贵平报道长沙市中小猪场和散养户病料中Mhp阳性率为 24.4%，Mhr阳性率为22.3%;Lin J H 等报道等［10］台湾 Mhp和 Mhr的感染率分别为15.9%和19.0%。本次试验从采集的屠宰场样品中检出Mhp阳性率23.3%，Mhr阳性率14.1%，这可能是采样时间、范围及对象的差异所致。这也说明Mhp和Mhr在猪群中也有感染，其对养猪业的危害值得进行调查。

Mhr由于其可感染动物和人，且培养要求较低，所以成为了支原体和细胞培养的头号敌人。据报道污染细胞的支原体主要来源于人、猪和牛，对495株细胞的检测，发现最常见的包括:发酵支原体(47%)、猪鼻支原体(19%)、口腔支原体(10%)、精氨酸直言体(9%)莱氏无胆甾原体(6%)、人型支原体(3%)［6］。本试验中从南京天邦生物科技有限公司生产的15批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)中均检测到了Mhp，而未检测到Mhr，说明疫苗在污染控制上严格。试验中检测的疑似支原体污染细胞均检测到了Mhr，这也验证了Mhr在细胞培养污染中的较为常见。

本试验中设计的双重PCR了3条引物特异性良好，敏感度与普通PCR接近，是一个较为简便快速的Mhp和Mhr检测和鉴定的方法。但本试验中Mhp和Mhr扩增产物在1000 bp以上，使PCR的延伸时间较短片段长，另两个目标片段大小相差129 bp，给两者的鉴别带来了一些困难。通过条件优化，2 h内即可完成检测，与常规PCR基本相当，目前也正在进行改进研究。

总之，采用双重PCR法检测可疑MPS病料，以及疫苗和细胞是否感染Mhp或者Mhr，是一种快速准确的检测诊断方法，对Mhp和Mhr的检测具有一定的应用价值。

［1］Elieen L T.Mycoplasmal Diseases［M］//.赵德明，张仲秋，沈建忠译.猪病学第9版.北京:中国农业大学出版社，2008:795-802.

［2］Maes D，Segales J，Meyns T，et al.Control of Mycoplasma hyopneumoniae infections in pigs［J］.Veterinary Microbiology，2008，126(4):297-309.

［3］沈青春，宁宜宝，覃青松.猪肺炎支原体的研究进展［J］.中国兽药杂志，2003，37(6):26-30.

［4］Lin J H，Chen S P，Yeh K S，et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan:Diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen.［J］.Veterinary Microbiology，2006，115(1-3):111-116.

［5］Hans G Drexler and Cord C Uphoff.Mycoplasma contamination of cell cultures:Incidence，sources，effects，detection，elimination，prevention［J］.Cytotechnology，2002，39(2):75-90.

［6］ 吴移谋，叶元康.支原体学［M］.第2版.北京:人民卫生出版社，2008:95-100.

［7］Freeman M J，Armstrong C H，Sands- Freeman L L，et al.Serological cross-reactivity of porcine reference antisera to Mycoplasma hyopneumoniae，M.flocculare，M.hyorhinis and M.hyosynoviae indicated by the enzyme-linked immunosorbent assay，complement fixation and indirect hemagglutination tests［J］.Canadian Journal of Comparative Medicine，1984，48(2):202-207.

［8］Caron J，Ouardani M，Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes［J］.Journal of Clinical Microbiology，2000，38(4):1390 ～1396.

［9］刘茂军，张 映，邵国青，等.猪支原体肺炎可疑肺组织PCR检测方法的建立［J］.山西农业大学学报(自然科学版)，2009，29(5):444-447.

［10］王贵平，戴 玮，贾小雅，等.用PCR检测长沙市猪肺炎支原体和猪鼻支原体的感染情况［J］.养猪，2011，(3):81-82.