超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡组织中氯苯胍残留

李慧素，吴宁鹏，班付国，彭 丽，周红霞

(河南省兽药监察所，郑州 450008)

氯苯胍(Robenidine)是一种新型高效合成抗球虫药，分子式为C15H13Cl2N5，相对分子质量为334，化学名:1，3-双-对氯苯叉氨基胍，其结构式如图1。

图1 氯苯胍化学结构式

氯苯胍自1977年在我国上市后，因其疗效显著、毒性小，具有提高增重和饲料利用率的作用，在兽医临床上得到广泛应用。然而，过量使用或长期使用不当会在禽肉产品中产生残留。有报道称，在肉鸡日粮中添加量为66 g/t时，屠宰的新鲜肉质中就会产生由于氯苯胍残留而产生的异味，以33g/t的含量饲喂蛋鸡时，在鸡蛋中就会察出异味。因此应在肉禽上市前5～7 d停药，产蛋禽禁用。但是，一些养殖者为追求利润，直到屠宰前才停止添加药物，这样肯定会使药物残留超标，危害人民的身体健康。为了保障动物性食品的质量安全，保证民众的健康和产品出口，有必要对动物性食品中氯苯胍的残留进行监控。

目前，中国、欧盟及美国等多个国家都制订了氯苯胍在动物源食品中的最高残留限量，我国农业部规定鸡皮与脂肪中的最大残留量为200 μg/kg，其他可食组织为 100 μg/kg［1］。目前，国外文献报道的有 HPLC［2］、HPLC-MS/MS 检测方法［3，6］，国内报道主要是高效液相色谱法。本方法参考已有的文献资料，通过多次试验，建立了能很好满足兽药残留检测方法要求的鸡组织中氯苯胍残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料 超高效液相色谱-串联质谱仪(Waters公司);XP205分析天平(瑞士 Mettler Toledo公司)，SIGMA 3-30K离心机(德国 Sigma公司);Spe-Al-N固相柱(500 mg/3 mL);HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL)。

1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯;氯苯胍标准品含量为 93.0%，购于德国 Dr.Ehrenstorfer Gmbh公司;D8-氯苯胍标准品含量为99.3%，购于Sigma-Aldrich公司。

1.3 标准溶液的配制 精密称取氯苯胍标准品约10 mg，置于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成1 mg/mL的标准贮备液。精密吸取标准贮备液1 mL，置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成100 μg/mL的标准中间工作液。

1.4 内标溶液的配制(1 mg/mL) 精密称取D8-氯苯胍标准品10 mg，于10 mL容量瓶中，用二甲亚砜溶解后，用甲醇稀释至刻度，制成1 mg/mL的内标储备液。准确吸取1 mL内标储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，制成 100 μg/mL的内标工作液。

1.5 试验方法

1.5.1 色谱条件色谱柱:Acquity UPLCⓇBEH C18(2.1 mm ×100 mm，1.7 μm);柱温30℃;流速0.3 mL/min;进样量 5 μL;流动相:A 相为乙腈，B相为0.1%甲酸水溶液;梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.5.2 质谱参考条件 电喷雾离子源;正离子扫描;多反应监测;源温度 120℃;脱溶剂温度350℃;电离电压3.0 kV;测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表2。

表2 氯苯胍及内标定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞能量

1.5.3 样品前处理 称取均质后(2±0.02)g试料，置于50 mL离心管内，加入1 μg/mL氯苯胍-D8内标溶液 100 μL，再加入 0.1% 甲酸乙腈5 mL，涡旋混合后中速振荡10 min，7500 r/min离心10 min，取上清液于另一10 mL离心管内，加水1 mL，混匀。中性氧化铝小柱用乙腈2 mL活化，取全部提取液过柱，收集全部流出液于10 mL玻璃试管中，再用85%乙腈2 mL洗脱，合并流出液，于40℃下氮气吹至体积小于2 mL，再加入水8 mL，备用。HLB固相萃取柱依次用甲醇3 mL、水3 mL活化，取全部备用液过柱，用水3 mL淋洗，抽干30 s，正己烷3 mL淋洗，抽干10 min，甲醇5 mL洗脱，收集洗脱液，于40℃下氮气吹干，残渣用85%乙腈1.0 mL溶解，涡旋，过滤后，供液相色谱-串联质谱仪测定。

1.5.4 标准曲线的制备 量取氯苯胍标准工作溶液适量，用85%乙腈稀释，制得浓度为10、20、50、100、200、500 ng/mL的系列标准溶液(内标均为100 ng/mL)，由低浓度到高浓度供液相色谱-串联质谱仪测定。以特征离子质量色谱峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

1.5.5 准确度与精密度 取空白组织，在肌肉、肝脏、肾脏组织中添加50、100、200 μg/kg 三个不同浓度，在脂肪、皮中添加100、200、400 μg/kg 三个不同浓度，分别进行准确度和精密度试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次，计算回收率及批内、批间相对标准偏差。

1.5.6 检测限与定量限 添加适量标准溶液于2.0 g空白样品中，经提取、净化后测定，依据信噪比S/N≥3为检测限，依据信噪比S/N≥10为定量限。

2 结果

2.1 标准曲线 按照上述方法制标准曲线，在选定的色谱条件下，氯苯胍回归方程为Y=8.9885X+146.89，相关系数 r=0.9985。结果表明:氯苯胍在120～500 ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性关系，r＞0.99。

表3 空白鸡组织中氯苯胍添加回收率试验(n=5)

2.2 准确度与精密度 按照上述方法，在空白组织中添加三个不同浓度的氯苯胍进行回收率试验。其结果见表3。可以看出氯苯胍在肝脏、肌肉、肾脏、脂肪和皮中平均回收率分别为 82.8% ～103.9%，85.0% ～ 107.6%、76.7% ～ 88.3%、80.9% ～91.6% 和 80.9% ～ 108.2%;批内变异系数均在 1.0% ～20.0%之间，批间变异系数在2.5% ～12.8%之间。氯苯胍的标准溶液、空白试样、空白添加试样特征离子质量色谱图见图2-图4。

2.3 检测限与定量限 氯苯胍在肌肉、肝脏、肾脏、脂 肪和皮中的检测限为5 μg/kg，定量限为10 μg/kg。

3 讨论

3.1 提取条件 已报道的氯苯胍提取用溶剂有乙腈［3-4］、乙酸乙酯［5］、甲醇［2］等，通过比较发现，乙腈的提取效果要优于甲醇和乙酸乙酯。根据氯苯胍的结构特征，考察酸化乙腈和碱化乙腈两种提取方法，发现用0.1%甲酸乙腈能获得更高更稳定的提取效果。

3.2 净化条件 文献中报道的用于净化的固相萃取柱有硅胶柱、阳离子交换柱、C18柱等。本方法参考文献的净化方法，选择 Wters Oasis HLB(3 mL，60 mg)、Waters Sep-Pak Vac C18(3 mL，60 mg)、VARIAN BOND ELUT-C18(3 mL，100 mg)三种固相萃取柱。结果发现三种固相萃取柱对氯苯胍的回收率差别不大，但C18柱批内的变异系数较大，因此选择HLB柱进行富集和净化。

3.3 除脂肪方法 常用去除脂肪的方法包括液液萃取法、有机溶剂柱淋洗法［4-5］和固相萃取柱净化。通过考察发现，在脂肪和皮组织中需要采用中性氧化铝［2-3］固相萃取柱和正己烷淋洗HLB固相萃取柱两步去除油脂，才能达到较好的净化效果和较高的回收率。

3.4 离子对的选择 根据欧盟2002/657/EC要求，要确证该类物质至少需要4个识别点(IP)，结合文献报道［3，6］，本试验分别选择了母离子以及对应的两个响应较强的子离子作为定性定量依据。分别采用ESI+和ESI-离子模式进行调谐，但以正离子模式响应值最高。

4 结论

本方法建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定鸡组织中氯苯胍残留，采用内标法，对五种基质样品提取、净化后测定，得到了较高的检测的灵敏度和回收率。通过方法学考察，本方法完全适合鸡组织氯苯胍残留的定性和定量检测。

［1］农业部235号公告.动物性食品中兽药最高残留限量［S］.

［2］Kot-Wasik A，Wasik A.Determination of robenidine in animal feeds by liquid chromatography coupled with diode-array detection and mass spectrometry after accelerated solvent extraction［J］.Analytica Chimica Acta，2005，543:46-51.

［3］Malgorzata O，Teresa S J，Piotr J.Multi-residue confirmatory method for the determination of twelve coccidiostats in chicken liver using liquid chromatography tandem mass spectrometry［J］.Chromatography A，2009，1216:8141-8148.

［4］刘勇军，吴银良，姜艳彬.高效液相色谱法测定鸡组织与鸡蛋中氯苯胍的残留量［J］.色谱，2010，28(9):905-907.

［5］周昭明，曾 勇，金秀娥.鸡、兔组织中氯苯胍残留的检测方法研究［J］.中国兽药杂志，2005，39(3):19-22.

［6］Delahaut P，Pierret G，Ralet N，et al.Multi-residue method for detecting coccidiostats at carry-over level in feed by HPLCMS/MS［J］.Food Additives and Contaminants，2010，27(6):801-809.