p38信号通路对SETD4在细胞中的表达和定位的影响*

叶 萍， 蔡军伟， 付晓霞， 崔 航， 刘亚伟， 陈小欢，罗海华， 李煜生， 刘 芸， 姜 勇， 刘靖华

(重大疾病的转录组与蛋白质组学教育部重点实验室，南方医科大学基础医学院病理生理学教研室，广东广州510515)

SET是一高度保守的结构域，因最初在果蝇的3个调节因子suppressor of variegation 3－9［Su(var)3－9］、enhancer of zeste［E(z)］和 trithorax的羧基末端发现而得名。含有SET结构域的蛋白被称为SET家族蛋白。SET家族蛋白广泛分布于酵母和动植物细胞中，目前经过分离鉴定以及理论推测的SET家族蛋白有 300多种，其中人类有48种［1－2］。

2000年，Stephen首次发现含有SET结构域的蛋白家族具有组蛋白甲基化转移酶的功能，即通过对组蛋白的甲基化修饰作用(主要作用于组蛋白H3/H4上的赖氨酸位点)影响染色体结构，调控基因表达［3－4］。近期研究发现，SET家族蛋白不仅具有组蛋白甲基化酶的作用，同时对非组蛋白也有甲基化酶的作用。如SET家族蛋白SET9、SMYD2可甲基化p53的不同赖氨酸位点，SETD6能甲基化核转录因子RelA(p65)310位赖氨酸，从而抑制炎症因子白细胞介素6(interleukin－6，IL－6)、IL－1和 IL－8等释放［5－10］。越来越多的研究表明SET家族蛋白通过上述甲基化酶作用参与了炎症及肿瘤的发生发展［11－12］。因此，探讨SET家族蛋白的功能对于阐明各种炎症相关性疾病及肿瘤的发生发展机制具有重要的理论价值。

SETD4(SET domain containing 4)属于SET家族蛋白中的一种，但是目前对其鲜见报道。为了探讨SETD4的生物学功能，本研究首先对SETD4在不同细胞中的表达和分布特点进行了观察，接下来观察了亚砷酸钠(sodium arsenite，NaAsO2)刺激对 SETD4蛋白表达水平和定位的影响，并初步研究上述改变是否与p38 MAPK信号通路有关。

材料和方法

1 材料

CO2培养箱(Heraeus)，细胞培养皿(Corning)，DMEM培养基(Gibco－BRL)，胎牛血清(HyClone)，SETD4多克隆抗体(Santa Cruz，编号 sc－133993，可检测人或鼠SETD4)，β－actin抗体(Bioworld Technology)，anti－rabbit抗体(Cell Signaling Technology)，ReverTra Ace qPCR RT kit(Toyobo)，Alexa Fluor 594偶联的抗兔IgG(Molecular Probes)，细胞裂解液(CST)，引物合成由深圳华大基因公司完成。小鼠胚胎成纤维细胞(wild－type mouse embryonic fibroblasts， MEFs， C57B1/6 background)p38+/+和p38－/－细胞系由美国Scripps研究所韩家淮博士馈赠。p38+/+细胞表达正常的 p38蛋白，p38－/－细胞则不表达 p38 蛋白［13］。

2 方法

2．1 细胞培养 NIH 3T3(小鼠成纤维细胞)、293T(人胚胎肾细胞)、Raw 264．7(小鼠巨噬细胞)、QSG(人正常肝脏细胞)、HepG2(人肝脏肿瘤细胞)、SMMC(人源肝癌细胞)、U2－OS(小鼠骨肉瘤细胞)(以上细胞由本室保存)、p38+/+和 p38－/－细胞均用含有10%FBS的DMEM培养基在CO2培养箱(5%CO2，37 ℃)中培养。

2．2 NaAsO2刺激细胞实验 细胞接种在6 cm培养皿中，待细胞长至80%融合时，无血清培养6 h，再给予100 μmol/L NaAsO2刺激，分别在刺激后 0、0．5、1、2、3和6 h收集细胞，按下述方法提取细胞总蛋白。

2．3 Western blotting检测SETD4蛋白的表达 将收集的细胞用细胞裂解缓冲液(20 mmol/L Tris－HCl pH7．5，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L Na2EDTA，1 mmol/L EGTA，10%Triton，2．5 mmol/L 焦磷酸钠，1 mmol/Lβ－磷酸甘油，1 mmol/L钒酸钠)裂解细胞，提取细胞总蛋白。总蛋白用Bradford法蛋白定量，取等量的总蛋白行12%SDS－PAGE蛋白凝胶电泳，电泳结束后将蛋白电转移至PVDF膜。经5%脱脂奶粉TBST溶液室温封闭2 h后，再与1∶1 000稀释的I抗4℃孵育过夜，然后与1∶1 000稀释的HRP(辣根过氧化物酶)偶联的抗兔IgG室温孵育1 h，采用Pierce公司的SuperSignal West Pico化学发光底物进行显色，利用Kodak IS4000R图像工作站［Carestream公司(原Kodak)］进行化学发光检测。

2．4 细胞免疫荧光实验 接种1×105细胞至Petri皿中，6 h后补液，生长12～18 h，待细胞密度达到80%时换用无血清DMEM培养6 h，NaAsO2刺激组给予100μmol/L NaAsO2刺激1 h。弃去细胞上清，PBS洗涤细胞3次，以4%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS 洗3 次，5 min/次，然后用含 0．1%Triton X－100的 PBS(PBST)透化细胞膜5 min，PBS洗3次，5 min/次，用质量分数 0．1%硼氢化钠(NaBH4)孵育细胞5 min，PBST洗3次，5 min/次，用3%BSA封闭1 h，PBST洗3次后用抗－SETD4特异性抗体(1∶500稀释)4°孵育过夜，次日取出室温孵育1 h，PBST洗3次后，用 Alexa Flour－594偶联的抗兔IgG(1∶1 000稀释)室温孵育1 h，DAPI染核10 min，PBS洗3次，5 min/次，然后PBS封片，于Zessi荧光显微镜下观察和图像采集。

3 SETD4的结构预测

小鼠SETD4(accession number:P58467)和人的SETD4(accession number:NP_059134)一级结构信息来源于美国国家生物技术信息中心(the National Center for Biotechnology Information，NCBI);小鼠SETD4蛋白的二级结构采用 PSIPRED 3．0预测(http://bioinf．cs．ucl．ac．uk/psipred/)。

结 果

1 SETD4的结构特征

小鼠SETD4由439个氨基酸组成，人SETD4是440个氨基酸，两者序列的一致性为77%(338/440)，保守性为87%(382/440)。SETD4主要由2个结构域组成，位于羧基末端的SET结构域(小鼠:第33～278位氨基酸;人:第34～279位氨基酸)和位于氨基端末端的底物结合结构域(小鼠:第306～424位氨基酸;人:第307～425位氨基酸)，见图1A。小鼠SETD4的二级结构图有16个α螺旋(α－helix，粉红色)、8个 β折叠结构(β －strand，黄色)以及不规则卷曲组成，见图1B。

Figure 1．Characterization of SETD4．A:the domains of mouse SETD4(mSETD4)and human SETD4(hSETD4);B:the secondary structure of mouse SETD4．Subs－binding:substrate－binding domain．图1 SETD4的结构特征

2 SETD4在不同细胞中的表达

SETD4蛋白在鼠源(Raw 264．7、U2 － OS、NIH 3T3和MEFs)和人源(293T、QSG、HepG2和 SMMC)的细胞中均有表达，在总蛋白量相同的情况下鼠源细胞的表达水平较人源的高，并且鼠源细胞在40 kD附近有2条带，而人源的只有分子量较大的1条带，见图2。这提示尽管SETD4在不同种属、不同组织来源的细胞均有表达，但是其表达特征有一定区别。

3 SETD4在细胞中的定位

细胞免疫荧光结果显示SETD4在整个细胞中分布，以胞质较多，见图3。

4 p38 MAPK信号通路对NaAsO 2诱导的细胞SETD4蛋白表达的影响

Figure 2．Expression of SETD4 in different cells．图2 SETD4蛋白在不同细胞中的表达

p38+/+细胞受NaAsO2刺激后其SETD4蛋白的表达在0．5 h、1 h、2 h、3 h 没有明显变化，但在6 h 时明显下降;p38－/－细胞受 NaAsO2刺激后其 SETD4蛋白的表达趋势与p38+/+一致，即均在6 h时有明显减少，提示p38信号通路可能没有参与NaAsO2诱导的SETD4表达的改变，见图4。

Figure 3．The location of SETD4 in Raw 264．7 cells and MEFs(immunofluorescent staining，×600)．图3 SETD4在NIH 3T3、Raw264．7细胞中的定位

Figure 4．Expression of SETD4 protein in p38+/+and p38 －/－cells following NaAsO2 treatment．图4 NaAsO2刺激对p38+/+和p38－/－细胞 SETD4蛋白表达的影响

5 NaAsO2诱导的SETD4蛋白移位入核依赖于p38信号通路

实验发现，静息状态下 SETD4在 p38+/+、p38－/－细胞的胞浆和胞核中均有分布，但主要分布于胞浆中;100μmol/L NaAsO2刺激1 h后，p38+/+细胞核内 SETD4明显增多，但是 p38－/－细胞中SETD4的分布没有明显改变，提示NaAsO2能诱导SETD4蛋白移位入核，并且依赖于p38信号通路。另外，NaAsO2刺激后p38+/+和p38－/－细胞中SETD4蛋白在胞浆呈现点状聚集，见图5。

讨 论

我们的实验结果发现SETD4蛋白表达水平(含量)与种属有关，即在总蛋白量相同的情况下鼠源细胞SETD4蛋白表达水平(含量)较人源的高，而与细胞是否是肿瘤细胞关系不大，提示SETD4参与肿瘤的发生发展可能主要是通过改变活性形式而不是上调表达水平。SETD4的理论分子量是49 kD，但是我们在40 kD附近检测到鼠源细胞有2条带，而人源的只有分子量较大的1条带，提示SETD4的迁移率发生了改变，这可能与其剪切形式发生了改变或者发生了翻译后修饰有关。生物信息学分析发现，SETD4可能有多种不同的剪切形式，本实验观察到的结果属于哪种情况还有待实验的进一步证实。

Figure 5．Localization and translocation of SETD4 in p38+/+and p38 －/－ cells following NaAsO2 treatment(immunofluorescent staining，×600) ．图5 NaAsO2对p38+/+和p38－/－细胞SETD4蛋白的定位及移位的影响

p38是丝裂原活化蛋白激酶(mitogen－activated protein kinase，MAPK)家族中的一个重要成员，参与多种生理和病理过程的调节［14］。在不同刺激条件下，p38 MAPK可通过不同方式活化来介导不同细胞的生物学功能。例如，p38可分别通过磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白及酶等多种底物来调节应激、凋亡、炎症和细胞生长、分化等过程，而且还参与细胞恶性转化(malignant transformation)和肿瘤细胞侵袭转移(tumor invasion and metastasis)等病理过程的调控［15］。由于SET家族蛋白与炎症和肿瘤的发生发展有很大关系，因此，本研究用p38+/+和p38－/－细胞首先探讨了p38 MAPK对亚砷酸盐刺激后细胞SETD4表达的影响。结果发现无论是否有p38的存在，当细胞受到NaAsO2刺激后SETD4蛋白表达趋势一致，提示p38 MAPK对SETD4的表达可能不发挥主要的调控作用。接下来，我们研究了p38 MAPK对亚砷酸盐刺激后细胞SETD4定位及其移位的影响。结果表明，如果p38缺失，细胞被激活后SETD4蛋白就不能从细胞质向细胞核移位，提示SETD4的移位有赖于p38 MAPK通路。信号蛋白的亚细胞定位和激活后移位已成为细胞信号转导研究中的重要内容。目前认为，信号蛋白的定位和激活后移位以及伴随的与其它蛋白的可逆性结合是信号在细胞内进行有效传递的关键所在。在很多情况下，信号蛋白需要锚定于适配体蛋白、细胞骨架及细胞质膜结构，或与其上游激酶和下游底物结合来发挥正常功能。信号分子的特异性定位有助于细胞高效地完成各种正常功能和病理反应。因此，进一步明确p38 MAPK如何影响SETD4的移位及SETD4结合蛋白对阐明SETD4的功能，进而探索其在炎症和肿瘤发生发展中扮演的角色有非常重要的意义。

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