甲磺酸酚妥拉明抗心律失常的初步研究

许 菲

（蚌埠市第三人民医院，安徽 蚌埠 233000）

心律失常为心血管病中的常见疾病，包括慢性心律失常和快速性心律失常。目前，很多治疗心律失常药物的作用机制是通过影响心肌细胞膜上各种离子通道的活性状态而实现的［1，2］。有文献报道［3，4］，α肾上腺素受体激动剂有可能导致心律失常，而作为α肾上腺素受体阻断剂的甲磺酸酚妥拉明（Phentolamine Mesylate，PM）或许会抑制此作用，故本实验采用膜片钳全细胞记录技术研究PM对正常大鼠心室肌细胞膜钠离子通道电流的影响［5，6］，进而了解PM是否有抗心律失常作用。

1 材料

1.1 动物

选取体质量为200～250g的9～10周龄的SD大鼠（雌雄不限），由蚌埠医学院实验动物中心提供。

1.2 试药和仪器

实验药物：PM购自上海旭东海普药业有限公司。试剂：胶原酶Ⅰ型，购自Sigma公司，批号：No232－582－9。仪器：倒置显微镜（日本OLYMPUS公司）；膜片钳放大器（EPC－9，德国）；微电极拉制器（NARISHIGE，日本）；液压微电极推进器（NARISHIGE，日本）；显微镜摄像机（日本JVC公司）；模数／数模转化器（Digitata1200A／B，美国AXON公司）；恒温水浴箱（DR－HW－1型，北京）；心肌细胞封接监视器（SONY SSN，日本）；记录分析软件（Patch Clamp 6.01，美国AXON公司）。

2 方法与结果

2.1 细胞分离

单个心室肌细胞是采用酶解的方法进行分离。用苯巴比妥钠（30mg／kg i.p）麻醉后，立即开胸取出心脏，置于2℃的无Ca2＋台氏液中，心脏经修饰后固定在Langendorff灌流架上，用无Ca2＋台式液经主动脉根部逆灌流5min，用含胶原酶I及0.2%牛血清蛋白的无Ca2＋台氏液反复灌流12 min，至心脏膨大出现拉丝后从灌流装置上取下，剪成小块，吸管反复吹打，最后吸取上清液保存在KB液中备用。

2.2 细胞封接与全细胞记录模式的形成

取上述保存的心室肌细胞上层悬液数滴，滴于细胞池中，选取表面光洁、横纹清晰的心肌细胞为研究对象。使用液压微操纵器将电极靠近细胞进行封接，吸破细胞膜，补偿电容电流和电极串联电阻，形成全细胞记录模式。在使用10－5mmol／L PM干预前（对照）和干预后分别记录INa激活（电流－电压）、稳态失活、失活后再恢复刺激程序下的电流。实验中脉冲信号由Patch Clamp 6.01软件控制，通道信号经EPC－9膜片钳放大器放大，通过Ag－AgCl电极丝和填充电极内液的微电极导入细胞，产生的电流信号经EPC－9转换，为Patch Clamp 6.01软件收集和分析。

2.3 统计学处理

统计学处理由计算机通过Patch Clamp 6.01软件控制采集数据，用配对t检验进行统计学分析，计量数据均用（）表示，P＜0.05提示有显著统计学意义。

3 INa电流的记录

3.1 INa电流－电压曲线（I－V曲线）

维持电位在－80mV，阶跃＋10mV，逐步去极化至＋50mV，刺激频率1Hz，钳制时间60ms。为了消除细胞间因体积差异而造成的误差，电流值以电流密度（pA／pF）表示，将不同钳制电压下的INa电流密度绘成I－V曲线。观察10－5mmol／L PM干预组对大鼠心室肌细胞INa I－V曲线的影响。结果如图1所示，两组细胞INa的I－V曲线，在近－70mV激活，－40mV达峰值，＋50mV时反转。PM干预组与对照组相比，I－V曲线明显上移，且对照组和10－5mmol／L PM干预组的INa电流密度峰值分别为（－39.87±1.28）pA／pF（n＝8）和（－17.31±0.33）pA／pF（n＝8），PM 干预组较对照组INa电流密度峰值明显下降（P＜0.05）。但INa的电压依赖性趋势未发生改变，其反转电位、峰值电位、激活电位及I－V曲线的形态轨迹无明显影响。

图1 10－5mmol／L PM干预组和对照组的I－V曲线

3.2 INa稳态失活曲线

维持电位＝－80mV，条件脉冲－160mV～－50mV，钳制时间100ms，阶跃＋10mV，每次条件脉冲后紧跟一固定的去极化到－40mV的测试脉冲，持续时间25ms，以INa与最大激活时的INa的比值与对应条件脉冲膜电位作图得到钠通道失活曲线。观察10－5mmol／L PM干预组与对大鼠心室肌细胞INa电压依赖性稳态失活曲线的变化。结果如图2所示，PM干预组与对照组相比，INa电压依赖性稳态失活曲线明显向超极化方向移动。

3.3 INa失活后再恢复曲线

采用双脉冲刺激法，第一个脉冲维持电位为－80mV，去极化至－30mV，持续50ms，在第1个脉冲回到维持电位后给予第2个脉冲去极化至－40mV，持续30ms，第1个脉冲和第2个脉冲间隔时间依次是10ms、20ms、30ms，逐级递增至150ms。第1个脉冲和第2个脉冲的INa之比与相应的间隔时间作图，得钠通道失活后再恢复过程曲线。观察PM对失活后再恢复过程的影响。由图3可知，PM干预组INa失活后再恢复明显减慢，再恢复时间延长。

图2 10－5mmol／L PM干预组和对照组的INa稳态失活曲线

图3 10－5mmol／L PM干预组和对照组的INa失活后再恢复曲线

4 结论

本实验结果表明PM能降低正常心室肌细胞INa电流密度峰值，能使INa通道失活加速，失活后再恢复时间延迟；这些现象表明PM可以使心室肌细胞动作电位0相上升速率减慢，使心肌细胞间传导减慢，心肌细胞的兴奋性降低，使折返激动不易形成，从而可以降低快速性室性心律失常的发生率。

［1］ 戴德哉.严重心律失常的相关离子通道病及分子机制探讨［J］.生命科学，2008，20（1）：69－72.

［2］ 潘建红，姚民强，王佩显.原发性心电疾病的研究进展［J］.中国心血管杂志，2010，15（5）：403－405.

［3］ SHANNON R，CHAUDHRY M，et al.Effect of alpha1－adrenergic receptors in cardiac pathophysiology［J］.American Heart Journal，2006，152（5）：842－850.

［4］ KURZ T，YZMADA KA，et al.Alpha1－adrenergic systermand arrhythmias in ischaemic heart disease［J］.Eur Heart J，1991，12（2）：88－98.

［5］ 李媛，刘善文，李华荣，等.严重心律失常的相关离子通道病及分子机制探讨［J］.中国药理学通报，2011，27（9）：1205－1209.

［6］ 巫少荣，李自成，余健，等.大蒜素对心肌室细胞膜钠通道电流的影响［J］.中国病理学杂志，2011，27（4）：658－661.