2，3，7，8-四氯二苯-对-二噁英对 BRL-3A细胞增殖、凋亡及胰岛素样生长因子2表达的影响

王 珺，刘晓亮，刘彩霞，赵彦艳

(中国医科大学盛京医院1.妇产科，2.临床遗传科，辽宁沈阳 110004)

2，3，7，8-四氯二苯-对-二噁英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是二噁英类环境污染物中毒性最强的一种，主要来源于垃圾焚烧、农药生产和汽车尾气等。TCDD在自然界广泛存在，具有致畸、致癌、致突变作用［1］。此外，TCDD还损害免疫、皮肤等多个系统功能［2－3］。TCDD 对不同组织细胞呈现不同作用，它可诱导免疫细胞凋亡，使胸腺萎缩、免疫功能下降［2］;而在其他组织，TCDD 则会抑制细胞凋亡以及促进癌变［4］。

胰岛素样生长因子-2(insulin-like growth factor 2，IGF2)是一个主要在胚胎期表达的重要生长因子，出生后其在各器官表达水平迅速下降［5］。IGF2过度表达可导致组织细胞异常增生，与Beckwith-Wiedemann综合征等先天畸形性疾病发生有关［6］。前期研究发现，TCDD致畸胎鼠的肝组织中Igf2基因表达增高［7］。

为探索肝细胞增殖及凋亡在TCDD致机体损害中的作用，以及Igf2基因表达与二者间的关系，本研究以大鼠肝BRL-3A细胞为研究对象，观察TCDD对该细胞增殖和凋亡的影响，检测 Igf2基因在BRL-3A细胞中的表达，探讨TCDD致畸、致癌和致突变作用可能的新机制。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂及主要仪器

Trizol试剂购自Invitrogen公司;RT-PCR试剂盒购自Promega公司;噻唑蓝(MTT)、二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和碘化丙啶(propidium iodide，PI)购自Sigma公司;蛋白质测定试剂购自南京建成生物工程研究所;胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640购自Gibco公司。TCDD购自Cambridge Isotope Laboratories公司，用 DMSO配成溶液备用。碱性磷酸酶标记的山羊抗兔IGF2IgG抗体和β肌动蛋白抗体购自Santa Cruz公司。PCR探针及引物由TaKaRa公司合成。

1.2 主要仪器

Olympus TH4-200倒置显微镜为日本Olympus公司产品;Bio-RAD550酶标仪和Gel Doc 1000型凝胶成像系统均为美国Bio-Rad公司产品;CL-1000紫外交联仪为美国UVP公司产品;FASCalibur流式细胞仪为美国BD公司产品。Rotorgene 2000实时定量PCR仪为加拿大MBI公司产品。

1.3 细胞培养

大鼠肝BRL-3A细胞购自中国科学院上海细胞研究所。在含15%FCS、青霉素 100 kU·L－1、链霉素100 mg·L－1的 RPMI-1640 完全培养体系中，置37℃，体积分数为5%CO2，饱和湿度培养箱中贴壁生长。2～3 d传代1次，实验均选用对数生长期细胞。接种后，常规培养24 h，实验组分别加入不同浓度的TCDD，溶剂对照组加入等体积100%DMSO(DMSO终浓度不超过0.1%)。

1.4 MTT法检测细胞存活

密度为1×108L－1BRL-3A细胞接种96孔板，分别加入 TCDD 0，5，10，15 和 20 nmol·L－1(每个浓度3 个孔，TCDD 0 nmol·L－1为溶剂对照组)，继续培养24 h后加入20 μl MTT(5 g·L－1)作用 4 h，吸去培养液，加入100μl DMSO。同时设仅加等体积培养基、MTT和 DMSO的孔为本底对照孔。15 min后，酶标仪测定490 nm波长处吸光度(A)值，细胞存活 率 (%)=(A实验组－ A本底对照)/(A溶剂对照组－A本底对照)×100%。

1.5 流式细胞仪检测细胞凋亡

1.5.1 紫外线诱导BRL-3A细胞

取BRL-3A细胞弃培养基保持湿润置于紫外交联仪内，以 254 nm 波长，120 J·cm－2能量垂直照射0 min或2 min，再加入培养基孵育2 h。然后实验组加入 TCDD 10 nmol·L－1，溶剂对照组加入等体积100%DMSO，继续培养24 h后收集细胞，胰酶消化，制成细胞悬液，70%无水乙醇固定。复以RNA酶37℃孵育30 min，消除RNA对DNA量的干扰。调整细胞密度至 5×109L－1，加入等体积 PI 50 mg·L－1染液。用流式细胞仪进行单色荧光细胞流式计数，观察凋亡细胞百分比，每组实验重复3次。

1.5.2 血清饥饿诱导BRL-3A细胞

取 BRL-3A 细胞，实验组加入 TCDD 10 nmol·L－1、溶剂对照组加入等体积100%DMSO的有血清和无血清培养基培养72和120 h，然后收集细胞，PI染色行流式细胞计数，观察凋亡细胞百分比，每组实验重复3次。

1.6 荧光定量PCR方法检测Igf2基因表达

取BRL-3A细胞，实验组给予TCDD 10 nmol·L－1作用2，4，6，16及24 h，溶剂对照组给予等体积的100%DMSO，然后收集细胞，提取RNA，逆转录合成cDNA，作为模板，进行扩增。Igf2基因特异性引物和荧光探针序列为:上游:5'-GCCCTCCTGGAGACATACTG-3'， 下 游:5'-CCAGGTGTCGAATTTGAAGAA-3'，探针:5'-(FAM)-TCCGAGAGGGACGTGTCTAC-(TAMRA)-3'。反应体系包括:cDNA 1.0 μl，10 × PCR 缓冲液 2.0 μl，dNTPs 0.5 μl，引物各1μl，探针1μl，Taq酶5 U，加去离子水至总体积20μl，在实时定量PCR仪上进行扩增，反应条件为50℃ 120 s，94℃ 120 s预变性，然后 94℃ 15 s，53℃30 s，65℃ 30 s循环40次。内对照β肌动蛋白的反应条件相同，其特异性引物和荧光探针序列为:上游:5'-AGCAGATGTGGATCAGCAAG-3， 下 游:5'-AACAGTCCGCCTAGAAGCAT-3'，探 针:5'-(FAM)-CCTCCATCGTGCACCGCAA-(TAMRA)-3'。每个样品扩增3次，计算平均Ct值，以Igf2和β肌动蛋白表达量之比代表每个样品Igf2的相对含量。

1.7 Western印迹法检测IGF2蛋白表达

取BRL-3A细胞，实验组加入TCDD 10 nmol·L－1作用6和24 h，溶剂对照组加入等体积的100%DMSO，然后收集细胞，用单去污裂解液方法提取总蛋白，用Bradford法进行蛋白定量。取50μg蛋白样品上样，SDS-PAGE电泳(成层胶浓度5%，分离胶浓度10%)分离蛋白后，转移至硝酸纤维膜上(40℃，200 mA，1.5 h)。转印膜用 5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，再与一抗和二抗孵育，充分洗膜后加入显色剂反应至特异性条带出现，应用凝胶成像系统分析蛋白条带积分光密度值(integrated absorbance，IA)，以目的条带与β肌动蛋白的IA比值代表IGF2蛋白的表达量。每个样品重复3次取平均值。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 TCDD对BRL-3A细胞增殖的影响

表1结果显示，与溶剂对照组比较，经过TCDD 5～20 nmol·L－1处理后，细胞存活率明显增加(P ＜0.05)，TCDD 10 nmol·L－1处理组 BRL-3A 细胞存活率为(122.6±1.2)%，明显高于其他浓度TCDD作用细胞的存活率(P＜0.01)。所以在以后的研究中，采用 TCDD 10 nmol·L－1作为刺激浓度。

Tab.1 Effect of 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin(TCDD)on BRL-3A cell survival

2.2 TCDD对BRL-3A细胞凋亡的影响

2.2.1 TCDD对紫外线诱导的BRL-3A细胞凋亡的抑制作用

图1结果显示，无照射的溶剂对照组细胞凋亡率为(7.3 ±2.6)%(图 1A)，TCDD 10 nmol·L－1组细胞凋亡率为(6.7±3.2)%(图1B)，二者间无显著性差异。经紫外线照射2 min后，溶剂对照组细胞凋亡率为(26.4±5.0)%(图1C)，与无照射的溶剂对照组相比显著增加(P＜0.05);加入 TCDD 10 nmol·L－1共培养24h细胞的凋亡率为(12.2 ±3.2)%(图1D)，显著低于照射的溶剂对照组(P＜0.05)，说明TCDD能够明显降低紫外线诱导的BRL-3A细胞凋亡。

Fig.1 Effect of TCDD on BRL-3A apopotosis induced by UV radiation detected by flow cytometry.A:BRL-3A cells cultured with DMSO for 24 h;B:BRL-3A cells cultured with TCDD 10 nmol·L － 1 for 24 h;C:BRL-3A cells treated with UV for 2 min and then cultured with DMSO for 24 h;D:BRL-3A cells treated with UV for 2 min and then cultured with TCDD 10 nmol·L －1 for 24 h.

2.2.2 TCDD对血清饥饿诱导的BRL-3A细胞凋亡的抑制作用

表2和图2结果显示，正常培养基中培养不同时间的溶剂对照组和TCDD 10 nmol·L－1组细胞的凋亡率无显著性差异。血清饥饿72和120 h后，溶剂对照组与TCDD 10 nmol·L－1组凋亡率均显著增加(P＜0.01);TCDD 10 nmol·L－1+ 血清饥饿组细胞的凋亡率明显低于血清饥饿+溶剂对照组(P＜0.05)，表明TCDD对血清饥饿诱导的凋亡具有抑制作用。

Tab.2 Effect of TCDD on BRL-3A apoptosis induced by serum free culturing

Fig.2 Effect of TCDD on BRL-3A apopotosis induced by serum free culturing detected by flow cytometry.A:normal medium+DMSO for 72 h;B:normal medium+TCDD 10 nmol·L －1 for 72 h;C:serum free medium+DMSO for 72 h;D:serum free medium+TCDD 10 nmol·L － 1 for 72 h;E:normal medium+DMSO for 120 h;F:normal medium+TCDD 10 nmol·L － 1 for 120 h;G:serum free medium+DMSO for 120 h;H:serum free medium+TCDD 10 nmol·L －1 for 120 h.

2.3 TCDD对BRL-3A细胞Igf2 mRNA表达的影响

图3结果显示，溶剂对照组BRL-3A细胞的Igf2 mRNA表达相对量为 0.037 ±0.003，TCDD 10 nmol·L－1作用后，Igf2 基因的表达量显著增高(P＜0.05)，TCDD作用6和24 h时 Igf2基因的表达量分别比对照组增高1.12倍和1.67倍。且TCDD调节表达的程度与作用时间有关，TCDD作用6 h前Igf2 mRNA的表达量与TCDD作用时间呈正相关(r=0.982，P=0.018)，TCDD 作用 6 h 之后Igf2 mRNA的表达增加趋势趋于平缓。

Fig.3 Effect of TCDD 10 nmol·L －1 on insulin-like growth factor 2(Igf2)mRNA expression in BRL-3A cells.±s，n=3.*P ＜0.05，compared with the 0 h group.

2.4 TCDD对BRL-3A细胞 IGF2蛋白表达的影响

图4 结果显示，溶剂对照组IGF2蛋白表达相对量为0.17 ±0.05，TCDD 10 nmol·L－1作用 6 和 24 h后，IGF2蛋白表达相对量分别为0.51 ±0.06，0.61 ±0.05，分别为溶剂对照组的3倍和3.6倍，有显著升高(P ＜0.05)。

Fig.4 Effects of TCDD on the expression of IGF2 protein in BRL-3A cells by Western blotting.Lane 1:solvent control group，lane 2:TCDD 10 nmol·L －1 for 6 h;lane 3:TCDD 10 nmol·L －1 for 24 h.

3 讨论

本研究结果显示TCDD能促进BRL-3A细胞增殖，并以 TCDD 10 nmol·L－1作用最强。TCDD 10 nmol·L－1对紫外照射和血清饥饿诱导的BRL-3A细胞凋亡均有明显抑制作用。

组织细胞的异常增殖和凋亡被认为与癌变和畸形发生相关［8］。本结果显示TCDD能刺激大鼠肝细胞增殖、抑制其凋亡，这可能是TCDD致畸和致癌作用的途径之一。

IGF2是一个重要的促细胞增殖的生长因子，其过度表达与肿瘤和先天畸形的发生相关［6，9］。TCDD作用24 h可引起BRL-3A细胞Igf2基因的表达显著增高——mRNA表达增高1.67倍，蛋白表达增高2.6倍。TCDD调节靶基因表达的主要作用途径是与芳香化烃受体结合，再与细胞核内的芳香化烃受体核转运体蛋白(Ah receptor nuclear translocator protein，ARNT)形成复合物，作用于靶基因上的二噁英反应元件(dioxin response element，DRE)，实现上调或下调基因表达，而产生毒性作用［10－11］。TRANSFAC-TESS和MATCHTM是常用的在线转录因子预测软件［12］，通过软件对Igf2基因进行分析并未发现该基因启动子上存在DRE。此外，TCDD作用于BRL-3A细胞所引起的Igf2基因mRNA增高的程度与IGF2蛋白上升的程度并不完全一致，这可能与蛋白翻译过程的各个环节还受到不同的调节有关。TCDD上调Igf2基因表达方式尚待进一步研究。

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