Liguzinediol的正性肌力作用机制及心脏安全性

徐 毅，罗卓卡，刘泉明，黄霏霏，李雪华，刘 磊，李 伟，陈 龙，4

(南京中医药大学药学院1.药理学教研室，2.中药化学教研室，江苏南京 210046;3.吴江市第一人民医院，江苏吴江 215200;4.泰州中国医药城中医药研究院，江苏泰州 225300)

2，5-二羟甲基-3，6-二甲基吡嗪(liguzinediol，LZDO)，是对川芎嗪(ligustrazine)进行结构修饰而获得的水溶性化合物。前期研究表明，LZDO能增加大鼠在体和离体的心脏收缩力［1－2］。急性毒性实验表明，雄性小鼠尾静脉给药的LD50为1.692 g·kg－1［3］;药物代谢动力学表明，LZDO具有良好的成药性，LZDO血药浓度(c)-时间(t)曲线呈二室模型，该药物可能通过肝药酶代谢［4］。本研究在此基础上，对LZDO正性肌力的作用机制进行初步探讨，并通过观察LZDO对豚鼠P-R间期，校正QT间期(QTc)间期，人类心脏钠通道(human cardiac sodium channel，hNav1.5)电流和人类果蝇相关基因(human ether-ago-go related gene，hERG)编码的钾电流的影响评价其心脏安全性。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

Liguzinediol自制(纯度为 99.3%，结构经UV，IR，NMR 和 EI-MS 确证)［1－2］。尼莫地平(nimodipine，Nim)与 rethenium red均购自 sigma公司;RM6240B/C(四道)型多道生理记录仪，YP J01型压力换能器和HSS-1(B)型恒温浴槽均为成都仪器厂生产。膜片钳放大器(200B)，数字-信号转换器(Digidata 1322A)和pClamp9.0软件均为美国Axon Instruments公司生产。微电极拉制仪(P-97)为美国Sutter Instrument公司生产。其他试剂均购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 大鼠离体心脏实验

健康清洁级雄性SD大鼠，体质量280～320 g，动物使用许可证:SYXK(苏)2002-0053。大鼠ip给予20%乌拉坦5 ml·kg－1麻醉，快速开胸取出心脏，置于0～4℃灌流液中使之停搏，修剪分离主动脉，行主动脉插管后，采用 Langendorff装置，充氧(95%O2+5%CO2)条件下，灌流系统经主动脉行离体心脏灌流 (mmol·L－1:NaCl 117，KCl 5.7，CaCl21.8，MgCl21.7，NaHCO34.4，NaH2PO41.5，HEPES20，葡萄糖11)，用NaOH调至7.4，温度为(37.5 ± 0.5)℃，灌流压 80 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)。采用插管法将压力感受器探头经左心房插入左心室，经压力换能器与RM6240型多道生理信号采集处理系统相连用于记录左心室收缩曲线。按照灌流液 (空白对照)→LZDO 100μmol·L－1→洗脱的顺序灌流，持续5 min并于灌流5 min末记录大鼠离体心脏左心室的各项心功能参数。再按照灌流液→Nim 1 μmol·L－1或 rethenium red 5 μmol·L－1→Nim 1 μmol·L－1+LZDO 100 μmol·L－1或 rethenium red 5 μmol·L－1+LZDO 100 μmol·L－1的顺序灌流。上一剂量灌流结束随后灌流下一剂量，每一组灌流持续5 min，分别记录各浓度组给药5 min后的左心室收缩压(left ventricular systolic pressure，LVSP)、左心室舒张末期压(left ventricular end diastolic pressure，LVEDP)、左心室内压最大升降速率(maximum rate of rise/decrease of left ventricular pressure，±d p/d tmax)和心率(heart rate，HR)。

1.3 豚鼠离体和在体心电图实验

1.3.1 豚鼠在体实验

10只豚鼠，体质量250 ～300 g，雌雄不拘，由南京中医药大学实验动物中心提供，实验动物使用许可证:SYXK(苏)2002-0053。豚鼠ip给予20%乌拉坦(5 ml·kg－1)麻醉，仰卧位固定，针形电极引导记录Ⅱ导联心电图，经四道生理记录仪采样并存入计算机。10只豚鼠分为2组，每组5只，分别经颈外静脉缓慢推注生理盐水或 LZDO 1.7 g·kg－1(LZDO被溶解在1 ml的生理盐水中)，持续5 min。给药前留有5 min平衡时间，于处理后5 min记录心电图，分析P-R间期及QTc间期。QTc=QT/RR间期的平方根［5］。

1.3.2 豚鼠离体实验

豚鼠离体心脏灌流同1.2。将3个电极分别置于心尖、右心室游离壁和主动脉根部。按照灌流液(空白对照)→LZDO 300 μmol·L－1顺序灌流，每一灌流持续5 min，给药5 min后记录离体心脏心电图并分析其P-R及QTc间期。

1.4 膜片钳全细胞方法记录细胞膜离子电流［6］

1.4.1 记录大鼠左心室肌细胞L型钙电流

采用常规大鼠心肌细胞分离方法［6］分离心肌细胞。在室温(20～22℃)下进行。细胞外灌流液为(mmol·L－1):NaCl 138，KCl 9，CaCl21，MgCl21，TEA-Cl 10，HEPES 10，用 NaOH 调至 7.4。电极(阻抗约为 5 MΩ)内液为(mmol·L－1):CsCl 130，MgCl22，EGTA 11，葡萄糖10，HEPES20，Na2ATP 2，GTP 0.1，用CsOH调至7.4。电压由－80 mV阶跃到－40 mV维持30 ms，然后由 －40 mV阶跃到0 mV维持300 ms，最后恢复到－80 mV。电流信号由与计算机相连的膜片钳放大器(Axon Instruments 200B，USA)放大并经数字-信号转换器与计算机对话，信号的发放和采集均由pClamp9.0软件完成，并将数据存储于硬盘内。按照灌流液(空白对照)→Nim 2 μmol·L－1顺序灌流左心室肌细胞，观察所记录的电流。另一组实验按照灌流液→LZDO 100μmol·L－1顺序灌流，于灌流 5 min末记录其 5个细胞L型钙电流。

1.4.2 记录 hNav1.5 电流

合成的 hNav1.5 cDNA(NM_000335.4)被克隆到带有G418耐药性的表达载体pcDNA3.1上。构成的质粒在脂质体2000转染试剂作用下，转染到无内源性 hNav1.5通道表达的 HEK细胞系中。hNav1.5细胞株通过规范的次代培养以维持最适宜的状态，并且DMEM培养基上培养(10%小牛血清和G418 250 mg·L－1)。稳定表达 hNav1.5 通道的HEK293细胞，培养于35 mm培养皿中，在37℃/5%CO2培养箱中放置至少24 h后用于实验。hNav1.5 HEK细胞系被广泛应用于hNav1.5通道的研究中［7－8］。记录外液(mmol·L－1:NaCl 25，TEA-Cl 122，MgCl21，葡萄糖10，HEPES10，CaCl21.8)，pH用NaOH调至 7.4，用蔗糖将渗透压值调至290 mOsm。记录内液(mmol·L－1:CsF 129，MgCl22，EGTA 11，HEPES 10，Na2ATP 3)，pH 用CsOH 调至7.2，用蔗糖将渗透压值调至277 mOsm。钳制电压为－80 mV，阶跃到－20 mV维持20 ms。按照灌流液(空白对照)→LZDO 1→10→100→300 μmol·L－1的顺序灌流，于灌流5 min末记录其5个细胞的电流。

1.4.3 记录 hERG 电流

合成的hERGcDNA(NM_000238.2)被克隆到带有G418耐药性的表达载体pcDNA3.1上，其他步骤同1.4.2 细胞株的制备。记录外液(mmol·L－1):NaCl 137，MgCl21.2，KCl 5.4，葡萄糖10，HEPES10，CaCl22，pH用NaOH调至7.4，用蔗糖将渗透压值调至 290 mOsm。记录内液(mmol·L－1):KCl 130，MgCl21，HEPES10，Mg-ATP 5，EGTA 5，GTP 0.1，pH用 KOH调至 7.3，用蔗糖将渗透压值调至290 mOsm。钳制电压为－80 mV，阶跃到－50 mV维持50 ms，然后施加到50 mV 4800 ms试验电压，最后施加到－50 mV 5000 ms试验电压。按照灌流液(空白对照)→LZDO 1→10→100→300 μmol·L－1的顺序灌流，于灌流5 min末记录其5个细胞的电流。

1.5 激光共聚焦测定左心室心肌细胞钙释放［9］

急性分离大鼠左心室心肌细胞［6］。细胞在37℃条件下，与 Fluo-3(5 μmol·L－1)共孵育30 min，用灌流液(同1.2灌流液)清洗5次，除去残留的Fluo-3。加载好荧光染料的细胞(选用横纹清楚、呈杆状、无收缩的细胞)置于Zeiss LSM 710倒置共聚焦显微镜系统的载物台上。0.5 Hz的局部场刺激由电子刺激器通过一对刺激电极以1.5倍阈强度的脉冲实施，从而触发细胞产生钙瞬变。共聚焦显微镜的成像方式为线扫描，采样速率为2 ms/线，共聚焦线扫描在局部场刺激开始前200 ms即开始，起始部分作为刺激前的本底对照。按照灌流液(空白对照)→LZDO 100 μmol·L－1的顺序灌流，分别于灌流LZDO 前及后 30 s，1，1.5，2，3，5，10，15，20，25，30，35，40 min末记录其5个细胞的钙瞬变。选择2 min(大约为钙瞬变最大值的开始时间点)和30 min(大约为钙瞬变最大值的末期)为分析点。实验获得图像用IDL程序处理，钙瞬变的大小以标准荧光强度(F)/F0表示，其中F0为静息状态荧光强度。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 LZDO对大鼠离体心脏和心肌电生理的影响

大鼠离体心脏收缩力(表 1)表明，LZDO 100 μmol·L－1能显著性增加LVSP，LVEDP 和±d p/d tmax，但对HR无影响，洗脱后出现部分回复。Nim 1 μmol· L－1+LZDO 或 rethenium red 5 μmol·L－1+LZDO同时灌入，LVSP，LVEDP，±d p/d tmax显著降低，与单用Nim或rethenium red作用相当，说明 Nim或 rethenium red可阻断 LZDO 100 μmol·L－1的正性肌力作用。

2.2 LZDO对豚鼠在体和离体心脏P-R间期及QTc间期的影响

豚鼠在体心电图(图1A)显示，生理盐水组和LZDO 1.7 g·kg－1组的 P-R 间期分别为(60 ±5)ms和(59±40)ms，QTc间期分别为(248±20)ms和(250±18)ms，两者间均无显著差异。

Tab.1 Effect of liguzinediol(LZDO)on positive inotropy in isolated rat hearts

豚鼠离体心电图(图1B)显示，空白对照和LZDO 300 μmol·L－1灌流的P-R 间期分别为(79±15)ms和(80±20)ms;QTc间期分别为(310±19)ms和(312±17)ms，两种灌流无显著性差异。

Fig.1 Effects of LZDO on P-R and QTc of guinea pig ECG in vivo(A)and in vitro(B).

2.3 LZDO对正常大鼠左心室肌细胞L型钙电流的作用

Nim 2 μmol·L－1能完全阻断所记录的电流，表明该电流为L型钙电流(图2A)。LZDO 100μmol·L－1对L型钙电流无显著性作用(图2B数据未显示)。

Fig.2 Effcet of LZDO on L-type Ca2+current from adult rat left ventricular myocyte.

2.4 LZDO对hNav1.5和hERG电流的影响

图3 和图 4可见，LZDO 1，10，100和300 μmol·L－1对 hNav1.5 和 hERG 电流无显著性的抑制作用。对照组 hNav1.5电流为(3920±442)pA，LZDO 1，10，100 和300 μmol·L－1组分别为3724±259，3656±346，3564±253和(3513±231)pA，与对照组无显著差异。对照组hERG电流为 (1205 ± 25)pA，LZDO 1， 10， 100 和300 μmol·L－1分别为1151±24，1106 ±24，1086±75和(1022±10)pA，与对照组无显著差异。

Fig.3 Effect of LZDO on hNav1.5 current.

Fig.4 Effect of LZDO on hERG current.

2.5 LZDO对大鼠左心室心肌细胞钙释放的影响

图5 表明，LZDO 100 μmol·L－1能明显增加大鼠左心室心肌细胞的钙释放量，2 min和30 min从标准化的对照组(100±4)%增加到(138±7)%及(139±12)%(n=5，P ＜0.05)。LZDO 增加心肌细胞钙释放的作用持续到30 min。而且 LZDO 100μmol·L－1未影响钙释放的基础水平。

Fig.5 Effect of LZDO on intracellular Ca2+transients in adult rat left ventricular myocyte.

3 讨论

本实验结果表明，LZDO增加大鼠左心室收缩力的作用与肌浆网的钙释放有关。LZDO并没有显著性改变豚鼠在体与离体心电图的P-R间期及QTc间期，LZDO 300 μmol·L－1并没有显著性抑制 hNa1.5和hERG电流，在心脏安全性评价实验中LZDO无致心律失常的作用。

本研究在前期研究工作［1］的基础上，证明LZDO对L型钙电流并无直接的作用，而L型钙通道又能介导LZDO的正性肌力作用，表明从L型钙通道活动到心肌收缩的链条中，LZDO作用于L型钙通道的下游。该链条可表述为动作电位到达心肌细胞膜→引起心肌细胞去极化→L型钙通道开发并导致Ca2+内流→内流的少量Ca2+引起肌浆网(SR)膜上的兰尼碱受体(ryanodine receptor，RyR)开放→钙诱导性钙释放(calcium-induced calcium release，CICR)→释放大量的Ca2+→肌浆网的Ca2+浓度下降→肌浆网膜上的钙泵(SR-Ca2+ATPase)活动→Ca2+重新泵入肌浆网中［10－11］。增加L型钙电流或者激活RyR可增加肌浆网钙释放［12－13］。L型钙通道阻滞剂Nim阻断了LZDO的正性肌力作用，是由于Nim阻断了CICR的过程，结合LZDO对L型钙电流无作用的实验结果，判断L型钙通道不是LZDO发挥正性肌力作用的靶点。本实验rethenium red通过阻断肌浆网钙释放的最后过程，使LZDO无法发挥正性肌力作用，说明LZDO发挥正性肌力的作用与肌浆网钙释放有关。大鼠左心室心肌细胞钙释放实验表明，LZDO 100 μmol·L－1能明显增加心肌细胞钙释放，并能持续到30 min。本研究表明，LZDO作用靶点不在L型钙通道，对L型钙通道并无直接作用，但L型钙通道被阻断后，CICR过程也无法实现，LZDO无法通过作用于RyR或肌浆网膜上的钙泵而发挥正性肌力作用。至于LZDO是否直接作用于RyR而发挥正性肌力作用，还有待于进一步研究。

人用药品注册技术要求国际协调会(ICH)关于心脏安全评估的S7B文件中做出了明确的规定［14］，药物心脏安全性评价分为必备实验(在体清醒动物心电图QTc和hERG实验)及追加实验(包括L型钙电流、钠电流、动作电位等)。对于药物实验的浓度及剂量也作出了明确的规定［15］，一般要求30倍临床使用剂量。考虑到LDZO无临床剂量可参考，本实验在体心电图实验采用LDZO的LD50的剂量，即1.7 g·kg－1，离体实验采用 LZDO 发挥正性肌力作用的中间浓度的30倍，即300μmmol·L－1。本心脏安全性实验表明，LZDO并未引起心律失常，也没有抑制hNav1.5与hERG电流，表现出良好的心脏安全性。

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