光纤生物传感器检测嗜肺军团菌方法的建立

宋玲玲 陈苏红 张敏丽 张宏刚 肖 瑞 王升启

1.军医进修学院，北京 100853；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

光纤生物传感器检测嗜肺军团菌方法的建立

宋玲玲1陈苏红2张敏丽2张宏刚2肖 瑞2王升启2

1.军医进修学院，北京 100853；2.军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850

目的 建立光纤生物传感器检测嗜肺军团菌的方法，为嗜肺军团菌提供一种快速、现场的检测手段。 方法 先用抗原或抗体包被光纤，再加入待测物质孵育6～10 min，最后加入荧光探针反应6～10 min，根据理化换能元件可以将荧光信号转换成电信号的原理，实现对样品的定性或定量检测目的。同时探讨了光纤修饰方法，包被缓冲液以及离子强度等因素对实验结果的影响。 结果 光纤生物传感器法检测嗜肺军团菌时，最低可检测到3×104cfu/mL，检测响应时间为20 min；伤寒沙门菌、大肠杆菌、结核杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌的检测结果均为阴性，显示出良好的特异性。 结论 光纤生物传感器检测嗜肺军团菌时，表现出快速、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，可作为嗜肺军团菌的一种初筛方法。

嗜肺军团菌；光纤生物传感器；光纤修饰

嗜肺军团菌是一种革兰阴性杆菌，为条件致病菌，是生物恐怖剂的一种，能引起高死亡率的军团病，自从1976年发现它能够引起人类疾病以来，已经造成了上万人死亡[1]。目前，嗜肺军团菌主要的检测方法包括细菌培养法、血清学检测方法、PCR法等[2]，其中，细菌培养法具有价格昂贵、耗时长、对人员技术要求比较高并且容易造成实验操作人员感染等缺点；血清学检测方法虽然操作快捷，但灵敏度低并且容易与其他菌存在非特异性结合；PCR法虽然灵敏度高，但是耗时长，操作复杂，需要昂贵的仪器设备，不能实现现场检测。因此，迫切需要一种快速、特异、灵敏的嗜肺军团菌检测方法。然而，光纤生物传感器具有快速、特异性强、成本低、操作简单、携带方便可以进行现场检测等优点，可作为嗜肺军团菌的一种初筛方法。本文建立了光纤生物传感器法并利用双抗体夹心的反应模式对嗜肺军团菌进行了检测，同时对其特异性、灵敏度、重复性等进行了评价，旨在建立一种快速、特异、灵敏并能够对嗜肺军团菌实现现场检测的方法。

1 材料与方法

1.1 试剂及仪器

丙酮、冰醋酸、30%的氢氟酸、30%过氧化氢、95%乙醇、50%戊二醛购自国药集团化学试剂有限公司；盐酸、硫酸购自北京兴青红精细化学品科技有限公司；（3-氨丙基）三乙氧基硅烷（APTS）、牛血清白蛋白（BSA）购自 Sigma公司；氨水购自西陇化工股份有限公司；硫酸-重铬酸钾洗液、光纤探头为实验室自制；超声波清洗器购自昆山市超声仪器有限公司；电热鼓风干燥箱购自重庆万达仪器有限公司。

1.2 抗体与细菌

兔 IgG（拜尔迪生物科技有限公司），抗兔 IgG·Cy3（abcam），鼠抗军团单抗（meridian），大肠埃希菌 O157（分离株），兔抗军团多抗（abcam），Cy3 试剂盒（GE Healthcare）；嗜肺军团菌（分离株），伤寒沙门菌（50097），痢疾志贺菌（分离株），结核分枝杆菌（标准株HRv37），小肠结肠炎耶尔森菌（分离株），霍乱弧菌 O139（标准株），金黄色葡萄球菌（ATCC25923），上述所有细菌均由浙江省疾病预防控制中心提供。

1.3 方法

1.3.1 光纤探头的制备与修饰

1.3.1.1 光纤探头的制备 先将光纤截成10 cm长并把两端磨平，再用手术刀将光纤从一端削去6.5 cm长包层，然后将削去包层的一端浸入30%的氢氟酸中腐蚀2～3 h直至被腐蚀部分的直径为（225±5）μm，保证光纤探头锥形部分的长度约为0.5 cm，最后将剩余的包层削去备用。

1.3.1.2 光纤探头的修饰 光纤作为生物传感器中的敏感元件，它修饰效果的好坏直接关系着实验结果的成败，本实验室比较了两种光纤修饰方法。方法1[3]：①光纤的清洗：将探头放入 piraha 溶液（浓 H2SO4∶H2O2=3∶1）浸泡 30 min，用超纯水进行充分清洗后，置于105℃干燥箱中干燥5 h；②氨基化修饰：将洁净的探头放入含2%的APTS丙酮溶液中反应1 h，先用丙酮清洗3次，再用超纯水充分清洗近中性；③醛基化修饰：将光纤放入5.0%（V/V）的戊二醛PBS溶液中，在37℃反应1 h后，用超纯水冲洗3次备用。方法2[4]：①光纤的清洗：将探头放入 piraha 溶液（浓 H2SO4∶H2O2=3∶1）浸泡 30 min，用超纯水进行充分清洗后，再置于105℃干燥箱中干燥5 h；②氨基化修饰：将光纤放入含1%APTS的乙醇溶液在室温反应25 min；再分别用乙醇和去离子水各超声清洗5 min，最后将清洗过的光纤置于115℃烘箱中干燥60 min；③醛基化修饰：将光纤放入10%的戊二醛水溶液中室温反应40 min；用去离子水超声清洗3次，每次5 min，最后将光纤室温干燥备用。

1.3.2 光纤的包被与检测

将修饰好的光纤浸入含一定浓度的抗原 （或抗体）的PBS溶液中于4℃包被过夜，然后用2 mg/mL的BSA封闭光纤1 h减少非特异吸附。将封闭好的光纤装入反应池内，先用PBS-T（含0.05%Tween-20）冲洗50 s，然后通过蠕动泵加入待检测物质反应6～10 min；再用PBS-T冲洗50 s，最后通过蠕动泵加入荧光探针反应6～10 min，通过传感器中理化换能元件可以将免疫复合物的荧光信号转换成电信号的原理，从而实现样品的定性或定量检测。

1.3.3 嗜肺军团菌的检测

先按照Cy3试剂盒的说明书对兔抗军团多抗进行Cy3标记，然后用透析的方法除去多余的Cy3，备用。包被好0.05 mg/mL鼠抗军团单抗的光纤插入反应池中，然后用PBS-T（含0.05%Tween-20）冲洗50 s，最后加入嗜肺军团菌和兔抗军团多抗·Cy3的混合液反应10 min，并记录实验结果。通过对梯度稀释的嗜肺军团菌进行检测，从而对其灵敏度进行评价。以伤寒沙门菌、大肠杆菌、结核杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌进行特异性检测。所有实验均重复3次以上，取结果的平均值。

2 结果

2.1 光纤修饰效果的比较

以采样时间（s）为横坐标，以信号值（MV）为纵坐标作图。结果如图1所示，用方法2修饰的光纤的信号值明显高于方法1，表明第2种方法比第1种方法修饰的光纤共价结合能力强。

2.2 包被液的优化

本研究比较了0.01 mol/L pH 5.0的醋酸盐溶液、0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液、0.01 mol/L pH 9.6的碳酸盐溶液3种缓冲液的包被效果。结果如图2所示，0.01 mol/L pH 8.0的Tris-HCl溶液作为包被缓冲液时，信号值最强，包被效果最好。

2.3 包被液离子强度的优化

本研究比较了 0.01、0.02、0.05和 0.1 mol/L 4种离子强度的Tris-HCl溶液的包被效果。结果如图3所示，Tris-HCl溶液的离子强度为0.01 mol/L时信号值最高，包被效果最好。

2.4 嗜肺军团菌检测方法的建立

本实验比较了两种反应模式，第1种反应模式：先用鼠抗军团单抗包被光纤，再加入待测的嗜肺军团菌，然后加入兔抗军团多抗，最后加入荧光探针抗兔IgG·Cy3；第2种反应模式：先用鼠抗军团单抗包被光纤，然后加入待测的嗜肺军团菌，最后加入兔抗军团多抗·Cy3。结果如图4所示，直接用兔抗军团多抗·Cy3作为荧光探针时，信号值最高，实验效果最好。因此，本研究最后确立，以双抗体夹心的反应模式对嗜肺军团菌进行检测，即以鼠抗军团单抗和兔抗军团多抗·Cy3分别作为捕获抗体和检测探针。

2.5 嗜肺军团菌方法的特异性评价

将浓度为1×107cfu/mL的伤寒沙门菌、大肠杆菌、结核杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌均稀释到1×105cfu/mL并进行特异性实验。结果如图5所示，用光纤生物传感器对嗜肺军团菌进行检测时，其与伤寒沙门菌、大肠杆菌、结核杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、霍乱弧菌、金黄色葡萄球菌、痢疾志贺菌不存在交叉反应，特异性良好。

2.6 检测嗜肺军团菌方法的灵敏度评价

以10倍梯度稀释浓度为3×102～3×105cfu/mL的嗜肺军团菌为模板进行检测，从而对其灵敏度进行评价。结果判断：当信号值大于上述6种细菌和空白对照的+3SD（78 MV）时，检测结果判为阳性；反之则判为阴性。结果如图6所示，嗜肺军团菌最低可检测到3×104cfu/mL。

2.7 检测嗜肺军团菌方法的重复性评价

用同一批次和不同批次修饰的光纤包被鼠抗军团单抗，对嗜肺军团菌以及伤寒沙门菌、大肠杆菌、小肠耶尔森菌等6种细菌进行多次实验。结果发现，嗜肺军团菌的检测结果均为阳性且随着菌浓度的降低，信号值也呈现明显的梯度关系；同时其对伤寒沙门菌、大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、痢疾志贺菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、霍乱弧菌的检测结果均为阴性。见表1、2。

3 讨论

光纤生物传感器由激光器、生物样品检测部分和信号转换装置三部分组成，由于其具有检测速度快、灵敏度高、生物特异性强、成本相对低、操作简单等优点，近年来逐渐成为研究的热点并被越来越多地用于微生物、环境监测、医学等方面[5-7]。研究发现，光纤的制备与修饰效果直接影响着实验结果，光纤探针纤芯直径的大小直接影响着包被效果和实验的重复性，同时光纤探针的锥形的长度及锥度等直接影响着倏逝波的透射深度。因此，需要建立标准化的操作方法来保证光纤修饰效果的一致性。本研究发现，将嗜肺军团菌与兔抗军团多抗·Cy3以一定的比例进行混合可以大大提高检测的灵敏度，反应链的延长会显著地降低实验的灵敏度。

表1 特异性重复实验结果（MV）

表2 灵敏度重复实验结果（MV）

近年来，光纤生物传感器从传感器中异军突起并显示了其特有的优势，它未来的发展趋势主要体现在以下几个方面：第一，由于纳米材料具有体表面积比大，表面活性高，对生物大分子吸附作用强，传导性好等优点，它被更多地应用在传感器中作为固定的材料；第二，由于计算机、物理化学等学科的融入，光纤生物传感器向小型化、智能化方向发展；第三，逐渐向产业化、商品化方向发展。随着这些研究的深入，光纤生物传感器有望成为一种嗜肺军团菌实时、在线和现场检测的技术手段。

[1]Fields BS，Benson RF，Besser RE.Legionella and legionnaires'diseases：25 years of investigation[J].Clin Microbiol Rev，2002，15：206-226.

[2]鞠晓红，方芳，马爱新.军团菌检测方法的研究进展[J].吉林医药学院学报，2007，28（1）：48-50.

[3]龙峰，施汉昌，何苗，等.倏逝波光纤免疫传感器探头的修饰及表征[J].化学学报，2008，66（4）：454-458.

[4]邹宗亮，王升启，王志清.用于寡核苷酸芯片制备载体的醛基载玻片的制备方法优化及性质研究[J].生物工程学报，2001，17（5）：498-502.

[5]Keeley D，King，George P，et al.Detecting staphylococcal enterotoxin B using an automated fiber optic biosensor[J].Biosensors and Bioelectronics，1999，14（2）：163-170.

[6]Evgeni E，Vladislav P，Matan B，et al.Creation of a fiber optic based biosensor for air toxicity monitoring [J].Sensors and Actuators B：Chemical，2011，155（2）：859-867.

[7]Jason C，Huang，Chang YF，et al.Detection of severe acute respiratory syndrome（SARS）coronavirus nucleocapsid protein in human serum using a localized surface plasmon coupled fluorescence fiber-optic biosensor[J].Biosensors and Bioelectronics，2009，25（2）：320-325.

Establishment of method of fiber optic biosensor for detection of Legionella Pneumophila

SONG Lingling1CHEN Suhong2ZHANG Minli2ZHANG Honggang2XIAO Rui2WANG Shengqi2
1.Chinese PLA Postgraduate Medical School,Beijing 100853,China;2.Institute of Radiation Medicine,Academy of Military Sciences,Beijing 100850,China

Objective To establish the method of fiber optic biosensor for the detection of Legionella Pneumophila,in order to offer a fast,field detection mean for Legionella pneumophila.Methods At first,antigen or antibody was used to coat fibers;then the sample was added to incubate about 6 to 10 minutes;finally,the fluorescent probe was added to react 6 to 10 minutes.The purpose of qualitative or quantitative determination for the sample could be achieved,depending on the electrical signals converted from fluorescent signals by physicochemical transducer.Meanwhile,the effects of fiber modification methods,coated buffers and ionic strength on experimental results had been studied.Results When fiber optic biosensor used for Legionella pneumophila detection,its limit detection can achieve as low as 3×104CFU/mL and its response time was about 20 min.The detection results of Salmonella Typhi,Escherichia Coli,Mycobacterium Tuberculosis,Yersinia Enterocolitica,Vibrio Cholerae,Staphylococcus Aureus and Shigella Dysenteriae were all negative,which showed favourable specificity.Conclusion Fiber optic biosensor shows advantages of rapid,high sensitivity,good specificity and reproducibility in detection of Legionella pneumophila.It can be used as a screening method for Legionella pneumophila detection.

Legionella Pneumophila;Fiber optic biosensor;Fiber modification

R345

A

1673-7210（2012）06（c）-0023-03

国家自然科学基金（31100712）。

宋玲玲（1985-），女，硕士研究生，主要从事生物传感器方面的研究。

肖瑞（1977-），女，助理研究员，主要从事生物传感器方面的研究。王升启（1962-），男，博士生导师，研究员，主要从事体外诊断试剂方面的研究。

2012-03-09 本文编辑：程 铭）