硫化氢对阿尔茨海默病大鼠海马信号分子一氧化氮和一氧化碳的影响

陈 涛 贾 佳 周发明 周少华※

H2S、NO和CO是机体产生的三种气体信号分子，它们广泛的组织分布和多样的生物学效应近年来成了研究的一个热点。研究显示这三种气体信号分子参与了脑缺血、认知功能障碍等神经系统疾病的病理生理过程［1～3］。目前这三种气体信号分子已分别被报道与阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)等认知功能障碍疾病有关。但AD中三种气体信号分子间在是否存在相互影响尚未见报道。因此，本研究通过对AD大鼠脑室内给予外源性H2S，观察大鼠海马诱导型一氧化氮合酶(iNOS)/NO体系和血红素氧合酶－1(hemeoxygenase－1，HO－1)/CO体系的变化，研究AD大鼠海马气体信号分子间的相互影响，为AD的病理生理机制研究提供实验依据。

1.材料与方法

1.1 实验分组与模型制备

1.1.1 分组 成年SD雄性大鼠24只(体重250～300g)，购自湖北医药学院实验动物中心。经Morris水迷宫(购自中国医学科学院)测试判定其空间辨别性学习记忆能力，剔除反应过于迟钝或特别敏感的大鼠，将选出的24只大鼠随机分为AD组、硫氢化钠(NaHS)组，生理盐水(NS)组，每组各8只。

1.1.2 模型制备与给药 AD组、NaHS组双侧海马区注射点(AP－3.5mm，ML±2.0mm，DV 2.7mm)分别注射 5μl(10μg)Aβ25～35，NS组则注射等量的生理盐水。将8号注射针做成的套管置入右侧脑室(AP－1mm，ML 1.5mm，DV 4mm)后固定好。NaHS组每日通过侧脑室给予 NaHS 14 μmol/kg，其余两组给予等量生理盐水，连续7天。术后每天给予青霉素钠2万单位肌注防治感染。

1.1.3 标本制作 断头取脑后在冰面上迅速分离大鼠双侧海马，冰生理盐水中漂洗后用滤纸吸干，置入0.5ml trizol的EP管中保存在－80℃冰箱备用。

1.2 海马组织中NO含量和iNOS活性的测定

1.2.1 NO含量测定:将冻存海马组织取出按质量/体积(W/V)1/10加入预冷的生理盐水，眼科剪剪碎后，用匀浆器制成10%组织匀浆，低温低速离心机3000r/min，离心10分钟，将离心好的匀浆上清用于测定组织中总蛋白含量、NO含量。按南京建成生物工程研究所生产的专用试剂盒参照说明书，先使用考马斯亮兰蛋白测定试剂盒测出海马组织总蛋白含量，一氧化氮测试盒(硝酸还原酶法)在波长550nm处测吸光度值，依据公式计算出NO含量。

1.2.2 iNOS活性的测定:依据 NOS催化L－精氨酸和分子氧反应生成NO，而NO与亲核性物质生成有色化合物的原理，应用南京建成生物工程研究所产一氧化氮合酶测定试剂盒检测各组大鼠海马组织匀浆上清中iNOS活性，结果以活力单位·毫克蛋白－1(U/mg·prot)表示。

1.3 海马组织中CO含量和HO活性的测定

1.3.1 CO含量的测定:取新鲜制备的海马匀浆上清0.5 ml，空白管中加入等量的蒸馏水，分别加入1 mg/ml的血红蛋白1ml，混匀，室温下反应10分钟，以蒸馏水调零，测定测定管和空白管OD541和OD555，求得二者的比值(R值)，应用100%HbO2和100%HbCO不同比例混合绘制标准曲线，根据标准曲线计算HbCO%，CO(μmol/L)含量=［HbCO% ×Hb(mg/l)×40000］/［100×海马组织(ml)×64456］。

1.3.2 HO活性的测定:取海马组织匀浆0.5mg，加入胆绿素还原酶4mg、还原型辅酶Ⅱ(NADPH终浓度0.8 mol/L)、6－磷酸葡萄糖(终浓度4mmol/L)、6－磷酸葡萄糖脱氢酶(1U)、血红素(终浓度20 mol/L)，加入pH 7.4磷酸钾缓冲液至1ml，充分混匀，于37℃水浴，避光反应20分钟，冰浴终止反应。然后用分光光度计测定波长463 nm和530nm的吸光度差值，胆红素消光系数为40/mmol/(L·Cm)，HO活性用生成的胆红素μmol/(g·h)来表示。

2.结果

如表1结果所示，同NS组相比，AD组和NaHS组海马组织中NO、CO含量均升高，iNOS、HO－1活性均增加，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)。同AD组同相比，NaHS组海马组织NO含量显著减少，iNOS活性明显降低，而CO含量增加，HO－1活性明显增强，差异具有显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

表1 三组大鼠海马NO、CO含量及iNOS、HO－1活性(±s)

表1 三组大鼠海马NO、CO含量及iNOS、HO－1活性(±s)

注:*P＜0.05 ＊＊P＜0.01 vs NS #P＜0.05 ##P＜0.01vsAD。

项 目 N NS组 AD组 NaHS组NO(μmol/L) 8 0.49±0.03 1.19±0.57＊＊0.57±0.07*##CO(umol/L) 8 0.22±0.03#0.31±0.04*0.39±0.06*#iNOS(U/mg pro) 8 0.28±0.07 0.71±0.39＊＊0.39±0.14*##HO－1(U/mg pro) 8 1.89±0.37 2.63±0.45*3.65±8.46＊＊##

3.讨 论

NO和CO是可溶性鸟苷酸环化酶的激活剂，能够影响中枢和外周神经系统，发挥着神经调节因子的作用，并且这两种气体分子参与了AD等神经系统疾病的病理生理过程，与认知、行为相关。H2S作为一种新型的气体信号分子，体内2/3的H2S则以NaHS形式存在，也参与了AD的病理过程［4，5］。

NO作为一种神经递质在中枢神经系统中发挥着双重作用，一方面NO对维持正常生理功能的神经保护作用，又在一定条件下又具有神经毒性作用。NOS是其合成的重要限速酶，NO依赖于NOS的活性，由NOS催化L－精氨酸而成。iN0S为非Ca2+依赖型，在正常生理情况下无活性表达，病理状态下被激活，产生大量NO，导致细胞毒性作用。而Aβ蛋白的沉积可以引起大鼠海马中的NO生成增多，引起认知功能障碍。Aβ诱导的NO/iNOS途径被认为是其在AD的一个重要神经毒性机制［5］。在本研究中，我们也观察到给予Aβ25～35后，大鼠海马iN0S活性增高，NO含量增加。而给予NaHS组大鼠海马的iNOS活性明显降低，NO含量显著减少。表明外源性H2S对iNOS/NO体系具有抑制作用，这可能是H2S在AD中神经神经保护的一个可能的机制。

CO也是体内通过激活cGMP而发挥第二信使的作用的一个重要的气体信号分子。内源性CO来源于血红素的降解，而HO是血红素代谢过程中的限速酶，HO的催化产物铁离子、一氧化碳和胆绿素/胆红素都是在调节机体氧化还原平衡中发挥着重要的作用。HO－l广泛存在于全身多种组织，氧化应激刺激能诱导其表达。而氧化应激反应是AD发病的一个非常重要的机制，HO－1在AD发病过程中起到重要的作用［7，8，9］。此外，HO －1 的高表达还可以减低神经细胞中磷酸化Tau蛋白的表达，这也是其神经保护作用的一个重要机制［10］。研究显示，H2S作为轴配体的辅基能与血红素蛋白结合，发挥着HO活性调节作用，H2S还可通过上调GABAB受体的表达及 CO 体系，减轻神经损伤［11，12，13］。在本研究中，AD组大鼠海马的HO－1/CO体系上调，对Aβ毒性损伤发挥保护作用，而给予NaHS后大鼠海马的HO－1/CO体系上调更加显著。

许多研究表明，NO、CO和H2S三种气体信号分子在生成的代谢途径、转运、作用靶点、信号转导通路及生物学效应上存在复杂的相互作用。在LPS刺激的小鼠巨噬细胞炎症反应的实验研究中，已经发现H2S可以激活巨噬细胞中HO－1/CO体系表达，而该激活作用介导了H2S对iNOS/NO的抑制效应［14］。尽管三种气体信号分子具体作用机制尚未明确，但目前认为cGMP、KATP通道、钙通道、NF－κB信号通路、MAPK信号通路可能参与了三种气体信号分子的生物学效应，它们都有可能是气体信号网络发挥效应的重要交叉点［15］。

综上可知，外源性H2S能抑制Aβ25～35诱导AD大鼠海马iNOS活性，降低NO含量，激活HO－1活性，增加CO含量。外源性H2S对iNOS/NO体系抑制作用，对HO－1/CO体系的激活可能是其在阿尔茨海默病中发挥神经保护作用的一个重要途径。NO、CO和H2S三种气体信号分子在AD病理生理中相互作用的具体机制值得进一步研究。

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