Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表达及激活规律的研究

章旭日 雷明星 连小华*

（1 长沙市贺龙体育运动学校，湖南 长沙 400100；2 第三军医大学基础医学部细胞生物学教研室，重庆 400038）

程序性细胞死亡（programmed cell death，PCD）也称细胞凋亡，在生物体维持内环境稳态、器官的生长发育、防御外在及内在伤害以及防止癌细胞的扩散等方面均起着非常重要的作用[1]。

毛囊作为表皮的附属器官，在出生后显示出周期性的活动特性[2]，包括生长期，退化期和静止期[3]。凋亡在维持毛囊的周期性活动中发挥着重要的作用，在退化期初期，一系列的凋亡信号通路被激活，有关促进与抑制凋亡基因之间的平衡调控被打破，一些内源性或外源性的凋亡因子开始诱导凋亡信号通路激活，毛囊的凋亡迅速发生[4,5]。

在毛囊凋亡的各种信号通路中，caspase家族的各类分子相互级联，在凋亡的发生中起着重要的作用。而Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游，是依赖Caspase凋亡机制中起执行者核心作用的关键分子，是细胞凋亡发生的关键步骤及一切凋亡信号转导的共同通路[6,7]，它的活化是凋亡进入不可逆阶段标志。Caspase-3发挥活性需要通过剪切pro-Caspase-3形成活性形式的Active Caspase-3。Active Caspase-3的形成是判断细胞凋亡是否执行的关键。

Caspase-3及其激活体广泛的表达在毛囊的各类细胞中，但目前对于系统的研究毛囊一个周期的Caspase-3及其激活体Active Caspase-3的表达情况知之甚少。由于Caspase-3对于毛囊周期性维持的重要特性，我们通过免疫组织化学系统的研究发现，Caspase-3及其激活体表达于毛囊的各个时期，表现为生长期较弱，而退化期很强，静止期较弱。而在毛囊一个周期中，Active Caspase-3在毛囊的各个时相点的表达量均低于Caspase-3的表达。我们的研究证明，Caspase-3及其激活体在毛囊中的表达具有高度的时空特异性，而毛囊的凋亡活动与Caspase-3及其激活体的表达呈正相关。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

Caspase-3抗体（santa craze公司），Active Caspase-3抗体（北京博奥森生物科技有限公司），免疫组织化学试剂盒（北京中衫生物技术公司），DAB显色试剂盒（北京中衫生物技术公司）。石蜡切片机（德国Leica公司）。

1.2 实验动物

取出生后11d，16d，18d，24d的C57BL/6小鼠各5只，体质量分别为130～150、150～170、170～200、200～250g。

1.3 实验方法

1.3.1 取材

取各鼠龄小鼠背皮4%多聚甲醛固定过夜，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡包埋。

1.3.2 免疫组织化学

5um石蜡切片二甲苯透明，梯度酒精水合，3%H2O2室温封闭15min，去除内源性过氧化物酶活性。柠檬酸微波抗原修复。滴加一抗，4℃孵育过夜。PBS洗，滴加二抗37℃孵育30 min，PBS洗，DAB显色。

2 结 果

2.1 免疫组织化学检测Caspase-3在B6小鼠毛囊周期中的表达

在小鼠出生后的11d（图1A，A’），Caspase-3主要表达与毛囊的毛球部和毛球部的上段的内外根鞘细胞中，而在小鼠毛囊处于退化期的16d（图1B，B’）和18d（图1C，C’），Caspase-3呈现强烈的核表达于毛囊的各类细胞中，特别是在内外根鞘中的表达量要明显高于在生长期的水平；当小鼠毛囊进入了静止期（图1D，D’），Caspase-3依然表达于毛干的外围。而毛囊的毛乳头细胞在各个时期都很少有Caspase-3的表达。

2.2 免疫组织化学检测Caspsae-3激活体Active Caspase-3在小鼠毛囊周期中的表达

在小鼠毛囊各时期中，激活体呈明显的核表达于毛囊的各类细胞中。在B6小鼠出生后的11d，激活体在B6小鼠主要表达在毛囊的毛母质，内外根鞘几乎没有表达；在B6小鼠出生后的16d（图1B，B’），毛囊刚进入退化期，激活体在小鼠毛囊的毛球中表达强烈，而在内外根鞘也有部分细胞开始表达；在小鼠出生后的18d，毛囊正值退化期，激活体非常明显的表达于毛囊的毛母质，而在内外根鞘的表达非常强烈，远高于生长期和退化期初期的水平。在静止期，激活体少量的表达于毛干的外围部位，且表达量处于各时期中最低水平。同样，毛囊的毛乳头细胞很少有激活体阳性表达。

3 讨 论

图1 免疫组织化学检测C57BL/6 鼠各个时期毛囊中Caspase-3表达

图2 免疫组织化学检测C57BL/6 鼠各个时期毛囊中Active Caspase-3表达

毛囊周期性的维持需要凋亡因子的参与，Caspase-3作为凋亡的关键分子，在毛囊发生凋亡时必不可少。研究显示Caspase-3广泛的表达于毛囊的各个部位中，并在要执行凋亡的时候实现激活，形成激活体Active Caspase-3。而以往对于Caspase-3在毛囊中作用往往是作为一个凋亡的指标而限制在某一个时相点，并没有进行系统的研究。我们对C57BL/6这种最常规的小鼠为模型，用免疫组织化学的方法检测了Caspase-3及Active Caspase-3在小鼠出生后毛囊生长期，退化期和静止期的表达及激活情况。首先，在表达部位上，我们的研究与以往的研究并无不同。在毛囊中，Caspase-3及激活体均呈明显的核表达于毛囊各类细胞中。在小鼠出生后毛囊处于生长期中后期，Caspase-3主要表达在毛囊的毛母质以及毛球部上段的内外根鞘细胞中，而其激活体主要表达在毛母质的细胞，在内外根鞘细胞中表达很少，这说明了虽然内外根鞘细胞有Caspase-3的表达，但没有被激活，所以其在生长期中后期并不会有大量的凋亡发生。在小鼠出生后16d，毛囊处于退化期的初期，Caspase-3及其激活体在毛母质和内外根鞘都有表达，而且要比生长期高。总体来说，Active Caspase-3在毛囊各个部位的表达都要低于Caspase-3的表达，说明在退化期初期，毛囊已经开始发生凋亡，但是凋亡并不是特别的明显。而在小鼠出生后的18d，毛囊处于退化期的中后期，Caspase-3及其激活体除了在毛母质表达增强，在内外根鞘的表达明显要比退化期早期高，这表明Caspase-3在退化期中期大量被激活，从而内外根鞘发生凋亡，也进一步证实了在退化期，毛囊的毛球部萎缩，内外根鞘缩短是跟Caspase-3的大量表达及激活是相关的。而在静止期，两者的表达都低于生长期和退化期，但Caspase-3与其激活体的表达有着很大的区别，Caspase-3表达在毛干的外围，包括干细胞所在的bulge区，而其激活体Active Caspase-3在这些部位的表达并不明显，说明Caspase-3并没有被激活。毛囊的静止期是一个相对静止的时期，其增殖和凋亡活动均不明显，通过Caspase-3及其激活体的表达分析正好证实了这一现象。

而在整个毛囊的周期中，Caspase-3及其激活体很少或者并没有在毛乳头细胞中表达，这表明毛乳头细胞在形成之后，其凋亡的进程并不会随着毛囊的周期而进行。所以，到了静止期，毛囊的细胞几乎已经凋亡完全，毛乳头的细胞还能够保留。与毛囊的其他结构不同，毛乳头细胞是真皮来源的细胞，有研究表明，毛乳头细胞是毛囊的信号源，所以，毛囊凋亡的信号源也很有可能是来自毛乳头细胞，而其自身的凋亡规律与毛囊的上皮型细胞并不相同，我们通过Caspase-3及其激活体在毛囊中的表达来看，也正好符合这个观点。

因此，认为Caspase-3的表达具有高度的时空特异性，其表达与激活诱导毛囊细胞的凋亡，调节毛囊的内环境稳态和周期性活动。但是，毛乳头的凋亡并不与毛囊的上皮型细胞的凋亡规律相同，毛乳头如何调节上皮型细胞的凋亡，及其自身的凋亡规律有待进一步深入的研究。

本研究从毛囊的一个周期中从生长期到静止期四个时相点Caspase-3表达及其激活体的表达变化规律，系统阐明了Caspase-3及其激活对于毛囊维持其内环境稳态以及周期特性的重要性，为研究毛囊凋亡及周期性活动提供了良好的基础。

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