通脉抗栓颗粒质量标准研究

张 洁 白 娟 李成网*

（安徽省医学科学研究院，安徽 合肥 230061）

通脉抗栓颗粒是根据临床经验方开发的六类中药新药，已获国家药品食品监督管理局颁发的临床批件（批件号：2007L05140），由当归、川芎、葛根、人参叶等中药组成，具有益气养阴，活血通脉等功效。用于脑血栓症见头晕目眩，头痛，肢体麻木或强急，气短乏力，便干便秘，口干口渴，舌质红或质暗淡等气阴两虚, 瘀阻脑络证。采用薄层色谱法对其中的当归、川芎、麦冬、人参叶进行定性鉴别，采用HPLC法对葛根中的有效成分葛根素进行含量测定，可有效控制通脉抗栓颗粒的质量。

1 仪器、试药与样品

Waters 600型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；UV 996型紫外检测器；AD-2型百万分之一电子天平（美国PE公司）；BP210S型万分之一电子天平（德国赛多利斯）；AS3120型超声清洗器（天津奥特赛恩斯）；葛根素为对照品（批号0752-9806供含量测定用）；人参皂苷Rb1对照品（批号704—8903）；人参皂苷Re对照品（批号754-9002）；人参皂苷Rg1对照品（批号0703-200119）；当归对照药材（批号120927-200310）；川芎对照药材（批号120918-200306）；麦冬对照药材（批号121013-200607）均购于中国药品生物制品检定所。甲醇、磷酸为色谱纯，水为重蒸水，其他试剂均为化学纯。通脉抗栓颗粒由安徽省华康医药科技开发有限责任公司提供（规格：每袋装8g）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 当归川芎的鉴别[1]

取本品15g，研细，加乙醚150ml浸渍1h后，超声处理5min，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯0.5mL使溶解，作为供试品溶液。另取当归对照药材和川芎对照药材各1g，分别加乙醚50mL，浸泡1h，超声处理5min，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯2mL使溶解，分别作为对照药材溶液。照薄层色谱法试验，分别吸取当归和川芎对照药材溶液3μL，供试品溶液10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-醋酸乙酯（9∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显两个相同颜色的荧光斑点。阴性对照无干扰。见图1。

图1 当归川芎鉴别薄层色谱图

2.1.2 麦冬的鉴别[2]

取鉴别（1）项下乙醚提取后的药渣，加乙醇100mL回流1h，滤过，滤液回收乙醇至干，加3%硫酸溶液10mL置沸水浴加热回流2h，用3%氢氧化钠溶液调pH至中性，水浴蒸干，残渣加氯仿2mL使溶解，作为供试品溶液，另取麦冬对照药材2g，加乙醇20mL回流1h，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法试验，吸取对照药材溶液10μL和供试品溶液10μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正己烷-醋酸乙酯（1∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸溶液，于105°C加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图2。

2.1.3 人参叶的鉴别[3,4]

图2 麦冬鉴别薄层色谱图

取本品5g，研细，加甲醇50mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水25mL使溶解，滤过，滤液加水饱和正丁醇提取3次，每次25mL，合并正丁醇提取液，用正丁醇饱和的氨试液洗3次，每次25mL，弃去氨试液，正丁醇液水浴蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rb1、Re、Rg1对照品，分别加甲醇制成每1mL各含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液5～10μL，对照品溶液3～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-醋酸乙酯-水（4∶1∶5）的上层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至色斑清晰，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照无干扰。见图3。

图3 人参叶鉴别薄层色谱图

2.2 葛根素的含量测定

葛根为方中君药，其主要成分为葛根素。用高效液相色谱法测定中药制剂中葛根素的含量的报道很多[5,6]。在参考文献的基础上，为了有效地控制本品的质量，建立了本品的葛根素的高效液相色谱法的测定法，经方法学考察，本法简便、准确、可靠、重现性好，可有效控制本品质量，其方法学考察如下：

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

2.2.1.1 对照品溶液的制备

精密称取葛根素对照品适量，加30%乙醇制成每1mL含60μg的溶液，即得。

2.2.1.2 供试品溶液的制备

取本品，研细（过4号筛），取0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇50mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.1.3 阴性对照溶液的制备

取缺葛根的阴性制剂，按供试品溶液制备项下的方法依法制备阴性对照溶液。

2.2.1.4 色谱条件的选择

色谱柱：Shim-Pack CLC ODS柱（150×4.6mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）；检测波长：250nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。在此条件下，葛根素与其它成分均能很好地分离，供试品中葛根素保留时间与对照品一致，且阴性对照无干扰，结果见图4。

图4 对照品、样品、阴性样品HPLC色谱图

2.2.5 线性关系考察

精密吸取葛根素对照品溶液（0.21744mg/mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分别置10mL量瓶中，加30%乙醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取20μL，依次注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，峰面积分别为：1516068、2931786、4409670、5889355、7336747。以葛根素的浓度为横坐标，相应的峰面积积分值为纵坐标，计算，得线性回归方程为：A=67140C+37047 r=0.99997（n=5）。表明葛根素在21.744～108.72μg/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2.6 供试品精密度试验

取按供试品溶液制备法制备的供试液（批号040805），按上述色谱条件注入液相色谱仪，连续进样5次，记录葛根素峰面积分别为:5179674、5275425、 5276877、5392464、5317029，RSD=1.46%，表明精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

将按供试品溶液制备法制备的供试液（批号040805）于0、1、2、4、6、8h按上述色谱条件重复测定一次，记录葛根素峰面积分别为:5463520、5417945、5489535、5464131、5471071、5561982，RSD=0.87%。表明供试液在8h内稳定。

2.2.8 重复性试验

取同一批号样品（批号040805）共5份，按供试品溶液制备法制备供试液，精密量取该溶液和对照品溶液各20mL，按上述色谱条件注入液相色谱仪，记录色谱图，计算葛根素含量分别为65.5728mg/袋，65.7864mg/袋，64.1368mg/袋，65.0384mg/袋，64.9488mg/袋，RSD=0.98%。表明方法重复性良好。

2.2.9 回收率试验

精密量取已知含量（65.0968mg/袋）的样品适量，分别精密加入葛根素对照品适量，按正文含量测定项下的方法依法制备供试品溶液并测定，结果见表1。

表1 回收率试验结果（n=6）

2.2.10 样品测定

对3批中试样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别精密吸取样品溶液和对照品溶液各20mL，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果

3 讨 论

3.1 本方为中药复方制剂，采用薄层色谱鉴别方法对方中的每一味中药均进行了鉴别，并进行了阴性对照试验，结果其方法简便且专属性强，可有效控制本品的质量。

3.2 关于葛根中葛根素的含量测定方法，文献报道很多，但在本制剂中未见报道，对流动相进行了选择，先后比较了甲醇-水（25∶75）、甲醇-水（22∶78）、甲醇-0.1%磷酸溶液（22∶78）、甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）。结果以甲醇-0.1%磷酸溶液（24∶76）为流动相最佳。

3.3 对供试品溶液制备的超声提取时间也做了考察，分别比较了超声处理10、20、30、40min的效果。结果表明，超声提取30min已能提取完全，因此超声提取时间选择30min为佳。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典[S].2000年版一部.北京:化学工业出版社,2000:433.

[2]余伯阳.不同麦冬假叶树皂甙元的含量比较[J].中国药科大学学报,1987,18(2):117.

[3]中华人民共和国卫生部药典委员会编.中华人民共和国药典[S].2000年版一部.北京:化学工业出版社,2000:6.

[4]苗明三,李振国.现代实用中药质量控制技术[M].北京:人民卫生出版社,2000:36.

[5]杨小平.RP-HPLC法测定感冒清热颗粒中葛根素的含量[J].药物分析杂志 2001,21(5):331.

[6]刘建峰.HPLC法测定舒心片中葛根素含量[J].西北药学杂志,2000,15(5):1990.