低氧运动干预对大鼠心肌细胞自噬作用的探讨

陈福刁，林文弢，黄丽英

(1.韩山师范学院体育系，广东潮州 521041;2.广州体育学院运动生化教研室，广东广州 510500)

低氧运动干预对大鼠心肌细胞自噬作用的探讨

陈福刁1，林文弢2，黄丽英2

(1.韩山师范学院体育系，广东潮州 521041;2.广州体育学院运动生化教研室，广东广州 510500)

目的:探讨常压低氧(13．6%氧含量)运动对大鼠心肌核转录因子NF-κB、Cyt c和自噬相关基因Beclin1的影响，为运动与低氧适应机制的研究和高原训练方案的制定提供理论依据。方法:采用酶联免疫吸附技术(ELISA)分别测大鼠心肌NF-κB、Cyt c和Beclin1的含量。结果:通过运动训练、低氧适应或者是低氧运动适应，都能使NF-κB和Beclin1不同程度升高，其中以HC和HiLo较为显著，Cyt c变化不明显，提示运动训练、低氧适应或者低氧运动适应都能诱导自噬的发生。结论:自噬相关基因Beclin1在低氧训练中产生的低氧适应机制可能是低氧刺激后细胞内产生ROS，ROS激活了NF-κB信号通路，使得Beclinl与NF-κB活性增高;通过长期的运动与低氧适应，可能ROS降低有效抑制NF-κB信号通路，使Beclinl和NF-κB产生了适应性变化，Cyt c从线粒体释放较少，提示细胞凋亡率减少，从而保护心肌细胞的作用。

低氧运动;自噬;Beclin1;核因子κB;Cyt c

作为一种细胞保护机制，自噬能降解和回收细胞器组分，受损线粒体能释放促凋亡因子如细胞色素C(Cyt c)，故自噬可能阻断凋亡。心肌富含线粒体，故自噬对心肌病理生理状态具有重要意义，具有心肌保护作用。Beclin1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对低氧适应的发生、发展起着重要作用。研究表明，低氧应激后细胞内ROS水平升高，激活了核因子κB(NF-κB)信号通路［1］，使Beclin1活性增高，可见低氧应激与Beclin1密切相关［2］。Beclin1基因主要通过与PI3K形成复合体来调节其他的ATG蛋白在自噬前体结构中定位，调节自噬活性［3－4］。已经证实通过上调Beclin1在哺乳动物细胞中的表达能够刺激自噬的发生［5］。自噬是细胞对内外界环境压力变化的一种反应，在某些情况下自噬还可导致细胞死亡，被认为是区别于细胞凋亡(I程序性死亡)的另一种细胞程序性死亡形式(II型程序性死亡)［6］。为此探讨低氧训练对大鼠心肌Beclin1、NF-κB和Cyt c的影响，从而了解低氧运动的干预对心肌细胞自噬的作用，为运动与低氧适应提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验对象

六周龄雄性SD大鼠40只，体重160～180g，分笼饲养，每笼5只，自由饮食，室温23～25℃，湿度40%～60%，自然光照，自由饮食。饲养室、用具等定期消毒灭菌。所有大鼠在常氧条件下先进行一周跑台适应性训练，使大鼠学会跑台运动并适应，强度从12m/min开始，递增到18m/min，运动时间15min。

1.2 运动模型

40只大鼠随机分为4组，每组10只，分别为低住安静组(LC)、低住低练组(LoLo)、高住安静组(HC)和高住低练组(HiLo)。实验中使用的低氧发生设备为美国Hypoxico公司制造的低氧分压系统。低氧组大鼠在该系统的低氧舱内模拟低氧(常压低氧:氧含量13.6%，模拟海拔高度3 500m)条件下生活、训练。使用自行研发的自动控制系统进行低氧环境的自动监控。动物跑台为杭州段氏大鼠跑台。温度维持在23～25℃，相对湿度40%～60%。常氧组大鼠在动物饲养室内生活、训练。高住组每天12h在低氧下生活，低练组每天常氧下训练1h(每周4次)，跑速为35m/min，共4周。

1.3 实验方法

各运动组在最后一次训练后24h取材，各相应安静组在同一时间进行取材。按0.3mL/100g体重剂量腹腔注射10%水合三氯乙醛溶液麻醉大鼠，迅速取出大鼠心脏，立即用液氮速冻，后保存于－80℃冰箱中。取心肌组织匀浆，在低温高速离心机中以差速离心法分离细胞浆和线粒体，在酶标仪上测定细胞浆Beclin1、NF-κB和 Cyt c。NF-κB、Beclin1和Cyt c ELISA kit试剂盒购自上海蓝基生物科技有限公司。所有数据在SPSS13.0软件上进行统计处理，采用独立样本T检验，以平均数±标准差(±s)来表示。

2 结果与分析

由表1可见，与低住安静组比较，各组心肌细胞液体内NF-κB都呈升高的趋势，HC和HiLo组且有显著性差异(P＜0.05);与低住低练组比较，HC和HiLo组NF-κB也相应上升，且HC组有显著性差异(P＜0.05)。与低住安静组比较，各组心肌细胞液体内Beclin1都呈升高的趋势，且都有显著性差异(P＜0.05);与低住低练组比较，HC和HiLo组Beclin1也都有上升现象，但不存在显著性差异;与高住安静组比较，HiLo组 Beclin1明显升高，且存在显著性差异(P＜0.05)。各组间心肌细胞液体内Cyt c没有显著性差异。

表1 低氧和运动训练的干预大鼠心肌细胞液NF-κB、Beclin1和Cyt c的变化

3 讨论

大量研究表明Beclin1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对低氧适应的发生、发展起着重要作用。NF-κB是一个多效转录因子，由2个DNA结合亚基p50、p65组成异源二聚体，在胞质中与抑制亚基IKBα结合，一旦接受激活信号，如氧化应激、低氧等，IKBα被磷酸化并从复合物种解离，激活靶基因的转录。

3.1 低氧运动对核转录因子NF-κB的影响

NF-κB为一个转录因子蛋白家族，包括5个亚单位:Rel (cRel)、p65(RelA，NF-κB3)、RelB和p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。最常见的NF-κB二聚体是p65与p50组成的异二聚体。NF-κB的抑制单位IκB通过其C末端特定的锚蛋白重复序列与NF-κB结合，并覆盖NLS阻止NF-κB向细胞核内转移。在静息的细胞中，NF-κB和IκB形成复合体，以无活性形式存在于胞浆中。当细胞受细胞外信号刺激后，IκB激酶复合体(IκB kinase，IKK)活化将IκB磷酸化，使NF-κB暴露核定位位点。游离的NF-κB迅速移位到细胞核，与特异性κB序列结合，诱导相关基因转录。NF-κB作为一种转录调节因子在体内各组织细胞中广泛存在，亦存在于心肌细胞、血管平滑肌细胞(VSMC)、血管内皮细胞(VEC)中，参与各种心血管疾病包括多种原因引起的心肌肥大的发生与发展。研究表明，低氧后细胞内ROS水平、IκBα的Tyr磷酸化水平和细胞核内NF-κB的激活量均高［7］。缺氧信号激活Ras、Raf信号通路，活化NF-κB，激活靶基因的转录。IKBα酪氨酸羟基化被认为是低氧/再氧合时的激活机制，长时间缺氧可激活IKBα的降解途径，进一步强化对NF-κB的激活作用。本文实验也观察到运动训练能使大鼠心肌细胞NF-κB活性有所升高，但没有显著性差异，而低氧适应或者是低氧运动适应，能上调大鼠心肌细胞NF-κB活性，可能是运动和低氧两种应激都能激活Ras、Raf信号通路，从而启动核转录因子NF-κB;实验同时发现高住低练组较高住安静组NF-κB的活性要低，可能是通过长期的运动训练和低氧适应后NF-κB产生了适应，因而其活性有所下降，这是一种适应性的表现。

3.2 低氧运动对自噬相关基因Beclin1的影响

自噬是由Ashford和Porter在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。自噬性溶酶体的作用底物是内源性的，即来自细胞内的衰老和崩解的细胞器或局部细胞质等，它们由单层膜包围，内部常含有尚未分解的内质网、线粒体和高尔基复合体或脂类、糖原等。自噬主要的生理功能是将胞质中的大分子物质(如蛋白质、RNA、过量储存的糖原等)和一些细胞内源性底物(包括由于生理或病理原因引起的衰老、破损的细胞器)在单位膜包裹的囊泡中大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。这个过程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态是至关重要的。运动能诱导自噬的发生，有氧运动通过上调自噬来介导心肌的保护作用［7－8］。本文实验也观察到运动训练自噬相关基因Beclin1含量升高，与文献报道的基本一致。

Beclin1基因也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。与其他细胞器相比，自噬体的半衰期很短，只有8min左右，说明自噬是细胞对于环境变化的有效反应。研究表明，低氧环境、缺血/再灌注刺激下产生氧化应激，从而使Beclin1活性增高，诱导细胞自噬发生［9－10］。Gurusamy［11］等报道缺血缺氧预适应能增强自噬的发生，从而保护心脏细胞，实验观察到经过低氧应激适应后，心肌细胞液体内Beclin1活性增高，这与文献报道相一致。Lum［12］等研究认为，各种原因引起的细胞内ATP水平的下降可以诱发自噬，从而保证细胞能量代谢的稳定，利于细胞生存，低氧运动应激心肌细胞ATP水平的下降，长期暴露在高原环境的人们，肌肉线粒体自噬发生［13］。Zhang［14］等研究发现，低氧诱导因子HIF-1诱导的BNIP3表达和Beclin-1与Atg5的组成性表达起着至关重要的作用，表明低氧也可以诱导细胞发生线粒体自噬。在长期处于低氧环境的细胞中，线粒体自噬可以阻止细胞产生过多的ROS，从而抑制细胞死亡。实验也发现低氧适应和低氧运动适应都能使自噬相关基因Beclin1不同程度升高，且低氧运动适应比低氧适应更能有效刺激自噬基因Beclin1的升高，且两种应激存在明显的差异性。由此，推测低氧运动可能会发生细胞自噬，但其机制有待于进一步深入研究。

3.3 低氧运动对细胞色素C(Cyt c)的影响

正常情况下Cyt c位于线粒体膜间隙，结合线粒体内膜且不能通过外膜。目前研究［15］认为:Cyt c从线粒体释放后，不仅使线粒体呼吸链电子传递受阻、细胞能量供应减少，而且释放到胞浆中Cyt c能与凋亡蛋白酶激活因子(Apaf-1)和Caspase-9形成复合体，活化Caspase-3，从而激活Caspase级联反应，诱导细胞凋亡。Cyt c释放后抑制ATP合成导致凋亡发生，这一过程发生在凋亡的晚期。Cyt c还具有抗氧化功能，因此推测其释放入胞浆后，必然导致细胞ROS自由基水平上升，进而引起细胞凋亡。

康凯夫等［16］研究认为Beclinl与NF-κB的关系密切，当细胞受到各种因素(如低氧、缺血/再灌注、TNF2α、钙超载、毒性化合物)刺激后，线粒体渗透性转运通道(MTP)开放，线粒体肿胀，释放Cyt c等凋亡因子。此时，细胞启动自噬来清除受损线粒体，避免凋亡因子释放进入胞质，同时提高细胞对低氧的耐受力，对细胞起到一定保护作用，这些外界信号同时激活了NF-κB信号通路，使得Beclinl与NF-κB活性增高［17］，低氧环境ROS产生增加，低氧应激MTP开放原因可能是ROS产生导致的。本文实验发现高住低练组胞浆中Cyt c没有明显增加，而且较高住安静组低，提示经过低氧与运动适应后，线粒体漏电减少，使ROS产生减少，因而只有少量的Cyt c释放到细胞浆。

4 结论

1)运动能使心肌细胞自噬活性升高，自噬相关基因Beclin1增加。

2)低氧刺激后心肌细胞内产生大量的ROS，ROS使IκB酪氨酸位点磷酸化，激活了NF-κB信号通路，从而使NF-κB活性升高。

3)自噬相关基因Beclin1在低氧训练中产生的低氧适应机制可能是低氧刺激后细胞内产生ROS，ROS激活了NF-κB信号通路，使得Beclin l与NF-κB活性增高，线粒体渗透性转运通道开放，线粒体肿胀，释放到胞浆的Cyt c等凋亡因子增加;通过长期的运动与低氧适应，可能ROS降低有效抑制NF-κB信号通路，释放到胞浆的Cyt c等凋亡因子减少，使Beclin1和NF-κB产生了适应性变化，从而保护心肌细胞的作用。

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Effects of Myocardial Cells in Rat of Autophagy by Hypoxia Training

CHEN Fudiao1，LIN Wentao2，HUANG Liying2
(1.P．E．Department，Hanshan Teacher’s College，Chaozhou 521041，Guangdong，China; 2.Sports Biochemical Faculty，Guangzhou Institute of Physical Education，Guangzhou 510500，Guangdong，China)

AIM:The effects of hypoxia training in atmosphere(concentration of oxygen is 13.6%)on the content of NF-κB，Cyt c and Beclin1，and the gene of autophagy were investigated，so that the theory of study on the mechanisms of hypoxic acclimatization and project of high altitude training is provided．Methods:the content of NF-κB，Cyt c and Beclin1 were assessed by ELISA．RESULTS:NF-κB and Beclin1 increased during training，hypoxic acclimatization and hypoxic training acclimatization，and HC and HiLo increased significantly．It showed that autophagy induced during training，hypoxic acclimatization and hypoxic training acclimatization．Conclusion:The mechanism in hypoxic acclimatization of the gene of autophagy Beclin1 may be:NF-κB and Beclin1 increase by ROS hypoxia-induced;NF-κB and Beclin1 developed acclimatization by NF-κB inhibited because of ROS decreasing，Cyt c didn’t increase，so that cardiocytes were protected．

Hypoxia training;Autophagy;Beclin1;Nuclear factor-kappa B;Cyt c

G804.7

A

1004－0560(2012)01－0070－03

2012-01-12;

2012-02-08

广东省科技计划项目(2010B060900113)。

陈福刁(1970－)，女，副教授，学士，主要研究方向为低氧预适应与民俗体育学。

黄丽英(1971－)，女，教授，博士，主要研究方向为运动与低氧适应，E－mail:huangliying@mail．tsinghua．edu．cn。

责任编辑:乔艳春

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