壮观链霉菌中抑菌组分的初步分离与纯化

易小利，郑 雪，俞玲娟，张正波，裘娟萍

(浙江工业大学 生物与环境工程学院，浙江 杭州 310014)

壮观链霉菌 (Streptomyces spectabilis)属于粉红孢类群，气生菌丝体为橙红色。孢子丝直，有时呈假轮生，含10～50个孢子，孢子为椭圆形，表面光滑呈鲜红色［1］。壮观链霉菌是大观霉素 (又称奇放线菌素或壮观菌素)的主要产生菌。大观霉素具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阳性菌及阴性菌均有较强的抑制能力［2］。

壮观链霉菌菌株LXR1H-8 是经基因组重排和传统诱变获得的菌株，其抑菌活性大大提高，尤其是抑菌组分对革兰氏阳性菌的高效抑制，而对革兰氏阴性菌如大肠杆菌的抑菌活性降低，与大观霉素的抑菌谱不尽相同，因而推测改良后的壮观链霉菌菌株LXR1H-8 的代谢产物发生了改变［3］。本试验目的在于利用生物自显影方法和TLC 方法跟踪抑菌组分，多次使用硅胶柱层析分离样品，获得较好的分离效果。

在活性组分分离纯化过程中常用的快速检测方法为化学显色法、紫外可见分光光度法和高效液相色谱法。由于试验初期没有标准品作为对照又不清楚其化学结构，难以进行定性和定量;若采用其他生物活性测定方法如滤纸片法，则需要大量的样品，在达到有效活性跟踪的目的时，也造成了活性组分的浪费，对于一些分离过程复杂的工艺来说，更是浪费原料，也不利于一些微量成分的分离与纯化［4］。本试验采用了生物活性检测法和TLC 分析相结合的方法，达到高效抑菌组分的分离纯化效果。

生物自显影法的原理是将具有生物活性的组分，如抗生素等，在薄层层析或是纸层析上分离后，将分离开的条带 (硅胶粉末刮取或剪切或直接覆盖)与有相当指示菌的培养基表面接触，在合适的温度下经过一定时间培养后，琼脂表面出现抑菌点而得到定位。通过这种方法进行活性检测，一方面可以节约原料，达到活性跟踪的目的，另一方面证实继续分离纯化可得到单一抑菌活性组分的可能性。

1 材料与方法

1.1 材料

壮观链霉菌LXR1H-8，试验指示菌藤黄八叠球菌 (Sarcina lutea)，由浙江工业大学微生物试验室保存。

斜面培养基:牛肉膏2.5%，可溶性淀粉2.0%，K2HPO40.05%，MgSO40.05%，NaCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.001%，pH 值7.2，121℃灭菌20 min。

菌丝体培养基:酵母膏0.4%，葡萄糖1.0%，蛋白胨 0.4%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.2%，K2HPO40.4%，pH 值7.0，115℃灭菌30 min。

鉴定培养基:蛋白胨6 g，酵母浸膏6 g，牛肉浸膏1.5 g，葡萄糖10 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值7.8，115℃灭菌30 min。

1.2 壮观链霉菌菌株培养

取活化后的斜面，以10% (V/V)的接种量接入摇瓶 (250 mL)种子培养基中，置于28℃，160 r·min-1旋转式摇床中培养24 h。以10% (V/V)的接种量将上述种子液接入30 mL 菌体培养基中，置于28℃，160 r·min-1旋转式摇床中培养120 h。

1.3 指示菌的培养及菌悬液的配制

取1 支新鲜藤黄链霉菌的斜面，用接种环挑取1 环在新的斜面培养基上划线，置于37℃恒温培养箱中培养12 h，备用。

使用时用已灭过菌的生理盐水将菌苔洗下，并测定其在600 nm 下的吸光度，调整菌液浓度至D值为1.5，备用。

1.4 生物自显影

在无菌条件下将制备好的藤黄八叠球菌菌悬液(D600=1.500，1 mL)加入到培养基中 (100 mL)，摇匀后倾注平皿，每个培养皿倒入培养基25 mL。待培养基凝固后，将已层析结束后展开剂完全挥发的硅胶板取出，刮取相应的条带粉末置于培养基表面，并在硅胶粉末处放置牛津杯，向其中加入50 μL 的甲醇溶液，目的在于抑菌组分充分溶解并随牛津杯均匀扩散，形成规则的抑菌圈。盖好平皿，将培养皿置于培养箱中培养12 h，观察试验结果。

1.5 TLC 跟踪抑菌组分

用铅笔在已活化的硅胶板 (GF 254)下端1 cm 处划一平行底边的细线并等距离标志点样点。点样采用0.3 mm 玻璃毛细管点样，点样直径小于2 mm，展开采用立式玻璃展开槽。先向展开槽中加入展开剂，静置30 min，使展开槽内部充满饱和气体，之后将硅胶板迅速放入，尽量不破坏展开槽内溶剂的饱和状态，进行线性上行展开。层析结束时取出硅胶板，及时用铅笔标记溶剂前沿，吹干后254 nm 紫外透射仪下观察展开结果。

1.6 壮观链霉菌发酵液中抑菌组分的粗提

取壮观链霉菌的发酵液10 L，经离心处理后，去除菌渣，加入适量的草酸除去Ca2+，离心，取上清液，用乙酸乙酯少量多次提取上清液，收集乙酸乙酯相，减压蒸干浓缩，获得棕色膏状物即为壮观链霉菌抑菌组分的粗提物。

1.7 粗提物的前处理

依次用MCI 柱层析和硅胶柱层析分离抑菌组分，收集洗脱液，采用TLC 方法，合并条带相同的部分，收集洗脱液浓缩蒸干，获得有效的抑菌组分C1(粗品)。

1.8 硅胶柱层析分离C1组分

1.8.1 展开剂的选择

用玻璃毛细点样管吸取少量C1在硅胶板上点样，选用氯仿-甲醇体系为20∶1，30∶1。依次展开，选择Rf=0.3～0.4 的展开体系。254 nm 紫外显色，观察试验结果。

1.8.2 色谱条带的抑菌活性跟踪

选择氯仿-甲醇体系 (30∶1)的展开色谱条带，将相应的色谱条带刮取下，分别用少许等量的甲醇溶解，检测方法同1.4 节。

1.8.3 上样洗脱

准确称取120 g 的硅胶干法装柱，柱规格为5 cm×60 cm。将少量甲醇溶解的样品C1(172 mg)加入硅胶拌样，干法上样，洗脱液氯仿-甲醇30∶1 (V/V)，洗脱流速约为4 mL·min-1，依次收集洗脱液，每管约12 mL，共收集40 管。TLC 分析收集的样液，展开剂为氯仿-甲醇30∶1 (V/V)。

1.8.4 硅胶柱层析分离C1x部分

准确称取120 g 的硅胶 (100～200 目)干法装柱，柱规格为5 cm×60 cm，将少量甲醇溶解的样品C1b(170 mg)加入硅胶拌样，干法上样，洗脱液石油醚-丙酮1∶1 (V/V)，洗脱流速约为4 mL·min-1，依次收集洗脱液，约每管12 mL，共收集80 管。TLC 分析收集的样液，展开剂选用石油醚-丙酮1∶1 (V/V)。

1.8.5 凝胶柱层析纯化Cv部分

量取已预先处理好的凝胶树脂HW-40C 300 mL，湿法装柱，柱规格2.4 cm×70 cm。样品Cv(20 mg)用少量的甲醇充分溶解，上柱吸附后再洗脱。洗脱液为分析纯甲醇，洗脱流速 1 mL·min-1，收集洗脱液，每管10 mL，共收集80管。TLC 分析收集的样液，展开剂为石油醚-丙酮1∶1 (V/V)。254 nm 紫外显色，观察试验结果。

1.8.6 液质联用 (LC-MS)方法

液质联用适于成分复杂的代谢产物分析，其原理为以液相色谱做为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。取目的组分Cv2少许，用甲醇稀释置于液相瓶中，根据已建立的液相条件，分析保留时间为25.127 h 的液相峰，ESI 正源。

2 结果与分析

2.1 硅胶柱层析分离C1组分

2.1.1 洗脱剂的选择

样品C1分别在a，b 2 块硅胶板上点样，展开体系为氯仿-甲醇，配比分别为20∶1 和30∶1。展开结果如图1 所示，目标条带已标记 (蓝色线圈)，其在a，b 2 块板的Rf值分别为0.48 和0.35。选择Rf=0.35 的展开体系作为硅胶柱层析的洗脱条件。

2.1.2 活性跟踪抑菌组分

样品C1在硅胶板上点样，展开后显色观察，将3 条较为明显的色谱带刮取下，采用管碟法检测3 条带的抑菌活性。12 h 后观察结果。如图2 所示，1 和2 无抑菌活性，3 有抑菌活性，抑菌圈22.0 mm。试验结果显示，1 和2 色谱条带为杂质，3 为目标组分。

图1 λmax254 nm 下C1活性组分在氯仿-甲醇体系中的层析

图2 色谱条带抑菌活性跟踪结果

2.1.3 上样洗脱

收集40 管洗脱液，每隔1 管洗脱液硅胶板上点样，展开后，紫外显色。如图3 所示，目标组分主要集中在17～23 管，但是目的条带 (蓝色线框标记)与杂带 (绿色线框标记)并未分开，展开剂为氯仿-甲醇 (30∶1)体系不适于上样洗脱。故合并洗脱液17～23 管 (C1x)，减压浓缩蒸干，获得C1x50 mg，用于下步的分离纯化。

图3 洗脱液1～35 管紫外 (λ254nm)显色结果

2.2 硅胶柱层析分离C1x部分

收集80 管洗脱液，自第11 管洗脱液开始，每隔1 管点样，薄层层析后进行紫外观察。如图4 所示，11～19 管主要是杂带，23～69 管是目的条带。故根据TLC 分析，可合并Rf值相同的部分。即真空减压浓缩23～69 管 (Cv)，蒸干获得20 mg。

2.3 凝胶柱层析纯化Cv部分

如图5 所示，收集40 管洗脱液，每隔1 管点样，展开显色后，23～33 管目的条带清晰，条带比较纯。故合并23～33 管，减压浓缩蒸干后获得Cv23.00 mg。且这部分的组分比较纯，基本是单一组分。

2.4 液质联用

2.4.1 样品Cv2的液相分析方法建立

利用分光光度计对样品Cv2(yxl-2)全波段扫描，波长为200～800 nm，结果显示最大光吸收值λmax=254 nm。样品在甲醇中溶解度较好，流动相选择甲醇-水体系，故液相条件设定为ZORBAX Eclipse XDB-C18 (5 μm，4.6 mm×250 mm)，检测波长254 nm，流动相为甲醇∶水=40∶60～90∶10(V/V)，0～ 60 min梯度洗脱，流速0.8 mL·min-1，柱温30℃，进样量为20 μL (图6)。

图4 洗脱液11～79 管的紫外 (λ254nm)显色结果

图5 洗脱液1～40 管紫外 (λ254nm)显色结果

图6 样品Cv2的液相分析图谱

2.4.2 样品CV2的质谱

如图7 所示，保留时间为25.127 h，样品CV2的分子量为1 448，与壮观链霉菌的代谢产物大观霉素、巴佛罗霉素A1(bafilomycin A1)、硝苯吡喃酮(nitrophenyl pyrone)、曲张链丝菌素(streptovaricin)、间环丙菌素(metacycloprodigiosin)、spectomycin 和壮观链菌素 (spectinabilin)等分子量均不相同，因此可推测是一种新的抑菌组分，样品CV2的化学结构鉴定还需借助其他图谱的分析。

图7 t=25.127 h，CV2的质谱

3 小结和讨论

采用生物自显影和TLC 相结合的方法跟踪壮观链霉菌发酵液中的抑菌组分非常明确且简便，测定结果不受杂质的影响。TLC 是被分离物质即样品、吸附剂和展开剂共同作用的结果，因此选择与样品及吸附剂相匹配的展开剂是分离效果好坏的关键。

本试验过程中多次采用了硅胶柱层析分离技术，该技术分离提取效果较好。采用硅胶柱层析分离技术需要注意一下几点:首先是装柱。试验选择干法装柱，将吸附剂通过漏斗倒入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，连接真空泵的一端，抽去柱内填料间的空气，使填料压实。其次是加样。在进行柱色谱操作时，被分离的样品用少许甲醇充分溶解，加入适量的粗硅胶充分吸附，在旋转蒸发器里于45℃的条件下蒸干，将样品均匀置于柱顶，尽量使样品带均匀平整，在样品面上塞入脱脂棉，以防加入洗脱剂时破坏样品带。第三是洗脱剂的选择。另外，薄层层析选择的展开剂作为硅胶柱层析动态洗脱时的洗脱剂，有可能不合适，试验过程中需要根据具体情况重新选择洗脱体系。作为展开剂的选择应尽可能从以3 方面考虑:毒性小，沸点适中，粘度小。最后，熟悉常用的洗脱体系方面的基础知识，如氯仿-甲醇体系，石油醚-丙酮体系等。

［1］金燕华，裘娟萍，何景昌，等.壮观链霉菌产生抗生素的多样性［J］.中国医学工业杂志，2006，37 (12):849-854.

［2］奥格雷迪著，李继光主译.抗生素及化学药物治疗［M］.沈阳:辽宁出版社，2002.

［3］夏云重.基因组重排与传统育种相结合选育大观霉素高产菌株［D］.杭州.浙江工业大学，2009.

［4］张绪敏.抗菌素微生物效价测定法［M］.北京:人民卫生出版社，1963.