高效液相色谱外标法快速测定苯巴比妥血药浓度

刘光斌，姜芳宁，高颖(甘肃省酒钢医院药学部，甘肃嘉峪关735100)

高效液相色谱外标法快速测定苯巴比妥血药浓度

刘光斌*，姜芳宁，高颖(甘肃省酒钢医院药学部，甘肃嘉峪关735100)

目的:建立高效液相色谱(HPLC)外标法快速测定人血清中苯巴比妥的浓度。方法:血清样品经甲醇沉淀后，以甲醇-水(40∶60，V∶V)为流动相，流速为1.0 mL·min－1，色谱柱为Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温为30℃，紫外检测波长为214 nm。结果:血清内源性杂质不干扰待测物的测定，苯巴比妥的线性范围为4.5～72.8 μg·mL－1，日内、日间精密度(RSD)均＜5%，样品稳定性良好。结论:该法灵敏、快速、准确、操作简便、线性范围宽，可用于苯巴比妥的血药浓度监测。

苯巴比妥;高效液相色谱法;外标法;血药浓度

苯巴比妥(phenobarbital，PBB)是一种广谱抗癫痫药，常用于儿童抗癫痫治疗，该药治疗窗狭窄、药动学和药效学的个体差异大，其血药浓度与疗效及不良反应有密切关系，仅依靠临床观察，短期内难以判断疗效或毒性。因此，进行血药浓度监测对个体化用药有重要的临床意义。PBB血药浓度的测定方法有荧光偏振免疫分析法(FPIA)［1］、酶联免疫法(EMIT)［2］、紫外分光光度法(UV)［3］、高效液相色谱法(HPLC)［2，4］等。上述方法各有优缺点，如FPIA法和EMIT法具有高度自动化、取血量小、操作简便、快速、准确、灵敏度高的优点，但试剂盒昂贵，测试费用较高;UV法优点是操作简单、费用低廉，但其灵敏度低、专一性差，容易受到血液中其他成分的干扰;而HPLC法具有分离度好、灵敏度高、专属性强、成本较低等优点，但存在样品前处理复杂、技术性较强的缺点。文献报道的HPLC测定PBB的方法大多采用内标法，鲜有外标法的报道。笔者采用HPLC外标法并直接用甲醇沉淀血清中蛋白的方法测定血清中PBB浓度，样品前处理不需要萃取、复溶等复杂操作，方法简单、快速、准确，现报道如下。

1 仪器与试药

日本岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪(配备四元高压泵，在线真空脱气机，自动进样器及其温控系统);岛津LC solution工作站;超纯水仪(杭州天创净水设备有限公司生产);AUW120D型电子分析天平(日本岛津公司生产，十万分之一);TG16-W台式高速离心机(长沙维尔康湘鹰离心机有限公司生产);PBB对照品(中国药品生物制品鉴定所提供，批号:171222-200504);试验用水为超纯水，甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm);柱温:30℃;流动相:甲醇-水(40∶60，V∶V);流速:1.0 mL·min－1;检测波长:214 nm;进样量:10 μL。

2.2 PBB标准溶液的配制

精密称取PBB 5.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得50.0 μg·mL－1PBB贮备液，精密吸取PBB贮备液2 mL置于10 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，摇匀，即得10.0 μg·mL－1PBB甲醇溶液，冰箱(4℃)保存。

2.3 血清样品的配制

取离心管数支，分别精密加入适量不同浓度的PBB标准溶液，氮气流吹干后，加入血清0.5 mL，配成血清中含PBB分别为相应浓度的标准血清样品和质控样品。

2.4 血清样品处理方法

于离心管中精密加入血清样品0.5 mL，加甲醇1 mL，涡旋混合3 min，12 000 r·min－1离心5 min后取上清液于另一离心管中在相同条件下二次离心，吸取上清液用0.22 μm的滤头滤过后置于自动进样分析小瓶中，精密吸取10 μL进样分析。

2.5 专属性试验

在上述条件下，PBB的保留时间为8.2 min左右。目标化合物峰形良好，能有效分离，无杂峰干扰测定，基线平稳，见图1 。

图1 HPLC色谱图Fig 1HPLC chromatograms

2.6 PBB标准曲线的制作与定量下限的测定

取离心管数支，分别精密加入4.5、9.1、18.2、36.4、72.8 μg·mL－1系列浓度的PBB血清样品，平行做5份样品，按“2.4血清样品处理方法”项下操作，记录色谱图，以血清中PBB的浓度(C)对PBB样品峰面积的平均值(A)做回归曲线(见图2 )，得回归方程为:C=7.462 79×10－5A+1.224 25(r=0.999 9)。PBB血清浓度在4.5～72.8 μg·mL－1范围内线性关系良好。信噪比以S/N=3∶1计，PBB的最低监测限为0.5 μg·mL－1。

2.7 重复性试验

取PBB标准液适量于离心管中，氮气流吹干后，加空白血清0.5 mL混匀，按“2.4血清样品处理方法”项下操作，平行做5管，记录色谱图，代入标准曲线方程计算PBB的血药浓度，精密度(RSD)=1.26%(n=5)。结果表明该方法重复性良好。

2.8 回收率和精密度试验

图2 标准曲线图Fig 2Stand curve chart

取离心管数支，分别取PBB标准液适量于离心管中，氮气流吹干后，加空白血清0.5 mL，配成浓度分别为4.5、36.4、72.8 μg·mL－1的PBB溶液，按“2.4血清样品处理方法”项下操作，记录色谱图，每个样品测定5次取平均值，代入标准曲线方程计算PBB的血药浓度，以实测值与加入质量浓度之比计算回收率。将以上低、中、高3种浓度的样品溶液做为质控样品，分别在同一天内测定5次计算日内精密度和连续3日内每日测定1次计算日间精密度，见表1 。

2.9 稳定性试验［3］

取离心管数支，精密加入PBB浓度分别为4.5、36.4、72.8 μg·mL－1的质控样品0.5 mL，平行制备5份，一份制备好按“2.4血清样品处理方法”项下操作后立即进样分析(A);一份于室温下放置4 h，同法操作(B);一份提取后于4℃放置12 h，进样分析(C);一份于冰箱中冷冻保存4周后取出融化，同法操作(D);另一份在4周内反复冻融3次，然后同法操作(E)。结果显示样品在不同的储存条件下对本试验方法均具有良好的稳定性，见表2 。

表2 血清中PBB的浓度平均值(μg·mL－1)Tab 2Mean serum concentration of Phenobarbital(μg·mL－1)

3 讨论

根据临床用药情况，对一些药物进行了测试，结果发现，地西泮、卡马西平、苯妥英、丙戊酸、氯丙嗪等均不干扰PBB的测定，说明本法可应用于PBB的血药浓度监测，患者如同时服用其他药物不会影响PBB的测定。文献报道的检测波长有245［2］、205［4］、240［6］、254［7］、214 nm［8］等。试验结果显示检测波长为214 nm时其血清组分干扰最小、吸收值较大、灵敏度较高，所以选取214 nm作为检测波长。选择沉淀剂时分别试用15%高氯酸、乙腈［8］、甲醇［4］，发现用15%高氯酸沉淀时回收率较低，乙腈和甲醇作为沉淀剂均能达到要求。考虑到甲醇毒性较低，更为安全，故选择甲醇作为沉淀剂。提高柱温可以降低流动相的黏度，增加样品在流动相中的溶解度，减少保留时间，故控制温度可调整其出峰时间。经过对不同柱温的测试，发现30～40℃时，PBB的出峰较好。比较30［9］、35［4，5］、40℃［8］时PBB的吸收峰分离度、峰形、拖尾因子等并无明显差异，为了延长色谱柱寿命并避免环境温度影响，故选择30℃作为柱温。一般作体外药物分析时均采用外标法，体内药物分析因提取步骤繁琐都采用内标法进行校正，但因为本方法仅仅使用甲醇沉淀蛋白，无提取等繁琐步骤，而且仪器稳定性、方法重现性均良好，故选择用外标法定量测定。另外，因本方法使用的高效液相色谱仪为自动进样系统，避免了进样体积的误差。使用手动进样系统能否达到良好的效果，尚需进一步研究。本法的苯巴比妥样品出峰时间在8.2 min左右，整个测定过程从抽血到测定完成仅需要不到1 h的时间，满足临床血药浓度简捷、快速的测定要求。

本文建立的HPLC外标法测定血清中PBB的血药浓度，方法简单，便于推广。本方法直接采用甲醇和水为流动相，节约了成本。所以本方法除了具备灵敏度高、重现性好、专一性强的基本要求外，还具有操作简捷、价格低廉等优点，是一种理想的血药浓度测定方法。我院已将该法应用于临床，常规监测PBB的血药浓度。

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Determination of Phenobarbital in Human Serum by HPLC External Standard Method

LIU Guang-bin*，JIANG Fang-ning，GAO Ying(Dept．of Pharmacy，Gansu Jiugang Hospital，Gansu Jiayuguan 735100，China)

OBJECTIVE:To establish a HPLC external standard method for rapid determination of Phenobarbital in human serum．METHODS:Serum samples were precipitated by methanol followed by separation on the column of Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)at 30℃．The mobile phase consisted of methanol-water(40∶60，V∶V)at a flow rate of 1.0 mL·min－1．The detecting wavelength was set at 214 nm．RESULTS:The intrinsic impurity of plasma did not interfere with the determination of analyte．The linear range of arbamazepine was 4.5-72.8 μg·mL－1．The inter-day and intra-day precisions were less than 5%．The samples showed good stability．CONCLUSION:The established HPLC external standard method is sensitive，fast，accurate and simple with wide linear range and thus it can be applied to the monitoring of serum concentration of Phenobarbital．

Phenobarbital;HPLC;External standard method;Serum concentration

文献标志码B

1672－2124(2012)09－0811－03

2011-10-28

2012-01-06)