P-选择素对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的作用*

郭四美， 亓翠玲， 叶 杰， 周 秦， 王丽京

(广东药学院血管生物学研究所，广东 广州 510006)

1000-4718(2012)07-1197-05

2012-02-17

2012-05-17

科技部“973”项目国家重点基础研究发展计划(No. 2010CB529702);国家青年基金资助项目(No. 30900764)

△通讯作者 Tel：020-39352126；E-mail：wanglijing62@163.com

P-选择素对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的作用*

郭四美， 亓翠玲， 叶 杰， 周 秦， 王丽京△

(广东药学院血管生物学研究所，广东 广州 510006)

目的研究P-选择素(P-selectin)在ApcMin/+小鼠肠道肿瘤中的作用。方法采用P-selectin基因缺失的基因工程小鼠和肠道肿瘤模型ApcMin/+小鼠杂交，计数ApcMin/+小鼠与ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠小肠及大肠肿瘤的数目，并测量其肿瘤体积，研究P-selectin对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的作用。结果与ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠在9周龄时肠道肿瘤数目与总负荷明显减少。结论P-selectin缺失能够显著抑制ApcMin/+小鼠肠道肿瘤的生长。

P-选择素； 基因工程小鼠； 肠道肿瘤

P-选择素(P-selectin)是黏附分子选择素家族的重要成员,是一种相对分子质量为14 kD膜糖蛋白，由胞外区的凝集素(lectin)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)及补体调节蛋白 (complement regulatory protein，CRP) 重复序列, 以及跨膜区和胞质区组成[1-3]。P-选择素主要储存在血小板的α颗粒和血管内皮细胞的韦伯氏小体(Weibel-Palade body)中。它可以表达在活化的血小板和内皮细胞表面，与中性粒细胞、单核细胞表面的P-选择素配体相互作用[4]。因此，P-选择素参与介导血小板活化或内皮细胞与多形核白细胞(polymorphonuclear neutrophil, PMN)、单核细胞黏附,在炎症、血栓形成中起着重要作用[5-8]。

P-选择素在肿瘤中的作用尚存在争议。P-选择素可以在恶性肿瘤组织中的血管内皮细胞中表达，临床研究表明P-选择素与恶性肿瘤的进展、转移以及预后呈正相关[9]。可溶性P-选择素在结直肠癌、恶性黑色素瘤、乳腺癌、肺癌、何杰金病和非何杰金氏淋巴瘤病人中血浆水平与健康人相比明显升高[10-14]，Schadendorf等[15]还报道,不同阶段的黑色素瘤患者血清中可溶性P-选择素均高于正常人，而且其水平与病情发展呈正相关。Kim等[16]给P-选择素敲除小鼠(P-selectin-/-小鼠)皮下接种肿瘤细胞后发现P-选择素缺失抑制了肿瘤的生长，但是具体的机制没有表明。上述研究均表明P-选择素促进了肿瘤的生长。

ApcMin/+小鼠是国际公认的研究肠道肿瘤的小鼠模型，具有可遗传、自发和稳定的特点，被广泛应用于肠道肿瘤的研究工作，包括对肿瘤细胞生长、新生血管形成、凋亡、肿瘤免疫以及肿瘤治疗药物开发的研究[17-18]。为进一步分析该基因在致肿瘤方面的作用，进而研究肿瘤的发生和发展机制，更好地利用此模型研究P-选择素对肿瘤的作用,我们构建了ApcMin/+P-selectin-/-小鼠模型。并通过观察ApcMin/+小鼠与ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠肠道肿瘤的数目、体积变化，研究P-选择素在ApcMin/+小鼠模型自发肠道肿瘤发生、发展过程中的作用。

材 料 和 方 法

1材料

1.1动物ApcMin/+(C57BL/6J-APCMin/J)小鼠和P-选择素敲除(B6.129S7-Selptm1Bay/J,P-selectin-/-)小鼠由美国Jackson实验室提供，C57小鼠购自广东省动物中心。SPF环境中饲养扩群，室温22～28 ℃，相对湿度50%～70%，自动光控(12 h明/12 h暗)。

1.2D仪器与试剂 独立送回风净化笼具购自苏杭实验动物设备厂,PCR仪为美国应用生物系统公司生产，蛋白酶K及dNTP为Sigma产品，PCR引物由广州英骏公司合成，Taq酶、Tris饱和酚及氯仿为广州康龙公司产品，溴化乙啶(EB)购于广州康龙生物科技有限公司，凝胶成像系统购于GE。

2方法

2.1建系及扩群 用ApcMin/+雄性和P-selectin-/-雌性成年小鼠以1∶3的比例杂交，其F1代中鉴定出突变型条带ApcMin/+阳性小鼠即为ApcMin/+P-selectin+/-杂交小鼠，用此小鼠与P-selectin-/-小鼠杂交，得到F2代中鉴定出突变型条带APCMin阳性和P-selectin-/-小鼠即为ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠。扩群用ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠与P-selectin-/-小鼠杂交即可。

2.2抽提小鼠DNA 小鼠剪尾1 cm于EP管中捣碎，加入500 μL DNA裂解液，10 μL蛋白酶K(20 g/L)，充分混匀，置55 ℃水浴锅中过夜。次日拿出消化好的鼠尾，10 000 r/min离心5 min，转移上清。上清用等体积饱和酚，氯仿各250 μL抽提，10 000 r/min离心5 min，转移上清，重复1次。取上清加入800 μL无水乙醇沉淀，轻摇匀，有白色絮状沉淀析出，即为DNA。10 000 r/min离心5 min，弃去上清。此时沉淀容易从黏附的管壁脱落，用移液器小心吸掉乙醇。自然无尘晾干后，用100 μL无菌去离子水溶解，4 ℃保存待PCR扩增、鉴定。

2.3ApcMin/+小鼠鉴定 按照Jakson实验室的标准方法扩增DNA,ApcMin/+小鼠上游引物5'- GCC ATC CCT TCA CGT TAG -3'，下游引物5'-TTC CAC TTT GGC ATA AGG C-3'，5'-TTC TGA GAA AGA CAG AAG TTA-3'。反应条件为: 94 ℃变性2 min , 94 ℃ 30 s , 55 ℃ 1 min, 72 ℃ 1.1 min,35个循环；72 ℃ 2 min。用凝胶成像系统观察电泳结果。

2.4P-selectin基因鉴定 按照Jakson实验室的标准方法扩增DNA ,P-selectin基因上游引物5'-CTG AAT GAA CTG CAG GAC GA -3'，下游引物5'- ATA CTT TCT CGG CAG GAG CA -3'，5'-TTG TAA ATC AGA AGG AAG TGG -3'，5'- AGA GTT ACT CTT GAT GTA GAT CTCC-3'。反应条件为: 94 ℃变性3 min , 94 ℃ 20 s , 64 ℃ 30 s(每个循环减少0.5 ℃), 72 ℃ 35 s，12个循环；94 ℃ 20 s,58 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，25个循环；72 ℃ 2 min。用凝胶成像系统观察电泳结果。

2.5小鼠肠道腺瘤数目及体积的测定 选取ApcMin/+杂交小鼠与ApcMin/+P-selectin-/-小鼠(9周，不分雌雄)，每组6只。颈椎脱臼法处死后分离出整个肠道，区分小肠与结直肠。将小肠平均分为3段，PBS冲洗干净后铺直于滤纸上，沿着纵轴将肠道剪开，用裹有少许棉花的镊子均匀将肠组织铺展开，和滤纸一起置于中性甲醛中固定过夜。固定后的组织用0.4%亚甲蓝瞬时染色。体式解剖显微镜×20倍视野下，依次观察拍照肠道中的每个腺瘤，用软件中的测量工具测量每个腺瘤的最长径及最短径，计算肿瘤体积。计算公式为：体积=4πab2/3(a为长径的一半，b为短径的一半)。小肠腺瘤体积以半椭球来计算，大肠腺瘤以椭球来计算[19]。计数完毕后每段肠组织分别置于装有70%乙醇中保存备用。

2.6病理学研究 小鼠脱颈椎法处死，进行详细尸体解剖检查。10%中性甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，镜检。

3统计学处理

结 果

1Min基因和P-selectin基因的鉴定

ApcMin/+小鼠和P-selectin-/-小鼠杂交，3代后，所得子代小鼠1、3、4号为ApcMin/+P-selectin-/-。ApcMin/+阳性小鼠有3条带，分别为1 000 bp、600 bp和340 bp。P-selectin+/-有2条带，一条带为322 bp,另一条带为172 bp;P-selectin-/-只有1条带，为172 bp。图1A为Min基因的鉴定图，1、3和4号小鼠是Min基因阳性的小鼠。图1B为P-selectin基因的鉴定图， 1～5号小鼠为P-selectin敲除小鼠，6号为P-selectin+/-小鼠。

2肠道肿瘤分级

将肠道固定后亚甲蓝染色，体式镜下观测。根据肿瘤位置和大小将其分级：小肠腺瘤小于2 mm×2 mm为小肠微腺瘤，见图2A；大于2 mm×2 mm为小肠腺瘤，见图2B；大肠上为大肠肿瘤，见图2C。如图2所示，小肠肿瘤多为息肉状，而大肠肿瘤多为蒂状肿瘤。

3ApcMin/+小鼠肠道腺瘤组织病理学特征

ApcMin/+小鼠腺瘤多发在小肠部位，显微镜下观察ApcMin/+小肠的组织病理形态，可以分为3级：正常小肠绒毛(图3A)，细胞排列整齐，肠道结构分层清楚；小肠增生期(图3B)腺管增生明显，腺管细胞层数增多变厚；小肠腺瘤(图3C)，多数为管状绒毛状腺瘤，较大的腺瘤其腺管呈现不规则分支、“背靠背”和共壁现象，瘤细胞明显复层化，部分核上浮至腔缘，核极向消失，具有明显异型性。

Figure 1. Identification ofApcMin/+andP-selectin-/-mice.A:PCR results ofMingene. 1:Min/+; 2: +/+; 3:Min/+; 4:Min/+; M:marker. B:PCR results ofP-selectingene. 1～5:P-selectin-/-; 6:P-selectin+/-; M: marker.

图1ApcMin/+小鼠和P-selectin-/-小鼠鉴定

Figure 2. Tumor grading in the intestine ofApcMin/+mice (×2).A: small intestinal microadenoma; B: adenoma; C: colon tumor.

图2ApcMin/+小鼠肠道肿瘤分级

Figure 3. Histopathological features of intestinal tissues inApcMin/+mice(HE staining, ×200).A: normal villus； B: hyperplasia； C: adenoma.

图3ApcMin/+小鼠肠道组织病理学特征

4P-selectin缺失对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤数目的影响

取ApcMin/+与ApcMin/+P-selectin-/-小鼠肠道(9周，每组各6只)，体式显微镜下观察并统计肠道肿瘤的数目。与ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠小肠上腺瘤数目明显较少；ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠的小肠腺瘤、小肠腺瘤总数与肠道总腺瘤数目均比ApcMin/+小鼠少，肠道腺瘤减少了约61.19 %(P<0.01)，而2种小鼠大肠肿瘤数目差异不显著(P>0.05)，见图4。以上结果表明，P-selectin缺失能够显著性抑制ApcMin/+小鼠肠道腺瘤的形成。

5P-selectin缺失对ApcMin/+小鼠肠道肿瘤体积的作用

对ApcMin/+与ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠肠道肿瘤体积进行统计。与ApcMin/+小鼠相比，ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠小肠上腺瘤体积明显减少；ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠的小肠腺瘤体积、小肠腺瘤总体积与肠道总腺瘤体积均比ApcMin/+小鼠小，肠道腺瘤体积减少了约59.10 %(P<0.05)；而2种小鼠大肠肿瘤数目差异不显著(P>0.05)，见图5。结果表明，P-selectin缺失能够显著抑制ApcMin/+小鼠肠道腺瘤的体积生长。

讨 论

家族性腺瘤性息肉病(familial adenomatous polyposis, FAP)是结直肠癌发生的癌前病变，患者结直肠部位多发成百上千个腺瘤性息肉，抑癌基因结肠腺瘤性息肉病基因(adenomatous polyposis coli,Apc)的突变是结直肠肿瘤的起始因素[20]。C57BL/6J-ApcMin/+小鼠品系由Dove实验室1990年建立，在小鼠同源Apc基因第850位点发生无义突变，产生的截短APC蛋白导致Wnt信号通路紊乱,继而导致肠道多发腺瘤，被认为是一种良好的FAP小鼠模型[21]。ApcMin/+小鼠整个生命周期内的肠道腺瘤发生发展规律：9周时腺瘤形成，随后小肠腺瘤数目不变，体积不断增大，15周以后腺瘤快速生长，24周时可能由于腺瘤体积过大及其对营养的消耗而导致贫血从而使多数小鼠致死。20多年来C57BL/6J-ApcMin/J小鼠被广泛应用于研究各种基因、药物或饮食对结直肠癌的影响[19,23-24]，但是关于其腺瘤发生发展规律却无文献报道。

图4P-selectin基因缺失减少ApcMin/+小鼠肠道肿瘤数目

图5P-selectin基因缺失减少ApcMin/+小鼠肠道肿瘤体积

P-选择素对肿瘤生长的作用还存在争议，而且具体的分子机制还不清楚。在P-选择素敲除小鼠体内P-选择素的功能完全缺失，因此可以利用此小鼠在体内研究P-选择素对肿瘤生长和转移的影响。

本研究用P-selectin敲除小鼠和自发性肠道腺瘤ApcMin/+小鼠杂交，建立P-selectin敲除背景下的自发肠道腺瘤小鼠(ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠)模型，可以认为是一种良好的用于研究早期结直肠癌发生发展的癌前病变动物模型。与前人研究中使用的裸鼠异体移植瘤模型相比，这种自发肿瘤的ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠模型更接近真实生理条件下肿瘤发生的过程。而且在这种自发肿瘤模型中，更接近自发肿瘤生长的病理过程。

本文通过同周龄比较ApcMin/+小鼠与ApcMin/+P-selectin-/-杂交小鼠肠道肿瘤的数目和体积，明确显示，P-selectin的缺失能减少ApcMin/+小鼠肠道腺瘤易感性，P-selectin缺失在肠道腺瘤中起到重要的抑制作用。但由于ApcMin/+小鼠大肠上肿瘤数目较少，肿瘤多发于小肠，P-selectin基因缺失对大肠肿瘤的影响不明显。基于在小鼠模型中的研究，P-selectin可能在人体肠道肿瘤中也同样起重要的抑制作用，确切的结果有待在人体中进一步研究。

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RoleofP-selectininintestinaltumorigenesisinApcMin/+mice

GUO Si-mei, QI Cui-ling, YE Jie, ZHOU Qin, WANG Li-jing

(InstituteofVascularBiology,GuangdongPharmaceuticalCollege,Guangzhou510006,China.E-mail:wanglijing62@163.com)

AIM: To investigate the role of P-selectin in intestinal tumorigenesis inApcMin/+mice (C57BL/6J-ApcMin/J).METHODSFemaleP-selectinknockout mice (B6.129S7-Selptm1Bay/J, that wasP-selectin-/-) were mated with maleApcMin/+mice. The offspring was genotyped forMin+/-andP-selectinnull mutantions, which wereApcMin/+P-selectin-/-mice. The tumor number and gross tumor volume in the small and large intestines of theApcMin/+P-selectin-/-mice andApcMin/+mice were determined.RESULTSP-selectindeficiency inApcMin/+mice resulted in significant decreases in the tumor number and gross tumor volume in the small intestine and total intestine.CONCLUSIONDeletion ofP-selectinsignificantly inhibits the tumorigenesis in mouse intestines. In addition, the results also suggest that P-selectin may be a marker for colon cancer.

P-selectin; Genetically engineered mice; Intestinal neoplasms

R363.2；R735.3

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.009