核黄素预处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤*

李 伟， 陆晓华， 赵 雪， 王国光

(皖南医学院基础部病理生理学教研室，安徽 芜湖 241002)

1000-4718(2012)07-1314-05

2012-01-04

2012-05-11

皖南医学院中青年科研基金资助项目(No. WK200827)

△通讯作者 Tel: 0553-3932476；E-mail: guoguangw1226@sina.com

核黄素预处理减轻大鼠肝缺血再灌注损伤*

李 伟， 陆晓华， 赵 雪， 王国光△

(皖南医学院基础部病理生理学教研室，安徽 芜湖 241002)

目的探讨核黄素对肝缺血再灌注损伤的影响及其机制。方法将24只SD大鼠随机分为3组，每组8只。假手术对照组(sham组)和缺血再灌注组(I/R组)大鼠喂以正常饲料，核黄素预处理组(R+I/R组)大鼠补充核黄素。喂养4周后，阻断大鼠肝门1 h，再灌注1 h建立I/R模型。术后采血并收集肝脏标本，分别检测血清及肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)水平和血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的活性；蛋白印迹法检测肝组织血红素加氧酶-1(HO-1) 表达情况；HE染色观察肝组织病理学改变。结果与sham组比较，I/R组大鼠血清AST、ALT活性及MDA水平均明显升高，SOD活性显著降低(P<0.01)；肝组织中SOD活性亦明显下降(P<0.01)，MDA水平及HO-1蛋白表达则显著增高(P<0.05)。而R+I/R组较I/R组大鼠血清AST、ALT活性及MDA水平均明显下降，SOD活性显著增强(P<0.01)；肝组织中MDA水平亦明显降低，SOD及HO-1蛋白表达显著增高(P<0.01)。组织切片显示I/R组大鼠肝细胞肿胀，炎症细胞浸润，小叶结构紊乱；R+I/R组大鼠肝细胞仅轻度肿胀，几乎无气球样变，小叶结构清晰。结论核黄素预处理对缺血再灌注肝脏具有显著的保护作用，其作用机制可能与核黄素通过降低MDA水平、提高SOD活性及HO-1蛋白表达，增强肝脏的抗氧化能力，减轻脂质过氧化反应有关。

核黄素; 肝脏; 缺血再灌注; 血红素加氧酶-1

缺血再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是导致肝脏移植和肝脏切除术后肝功能障碍及衰竭的重要原因，许多因素和调节介质在肝缺血再灌注损伤中发挥重要作用[1-2]。肝组织缺血再灌注引起氧自由基生成增多，从而导致肝细胞膜、线粒体膜、微粒体膜以及溶酶体膜发生脂质过氧化，最终导致肝损伤，是肝缺血再灌注损伤重要机制之一[3]。

核黄素(riboflavin)在体内以黄素腺嘌呤单核苷酸(flavin mononucleotide，FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，FAD)的形式存在，是生物体内黄素酶的辅酶。作为一种天然的抗氧化剂，核黄素具有可逆的氧化还原特性，能通过氧化还原反应清除自由基[4-5]。缺血再灌注损伤的发生、发展是一个连续的过程，是许多相关因子联合作用的结果，其中氧自由基产生的脂质过氧化物可以通过氧化浆膜，使膜的流动性和通透性发生改变，也可通过氧化核酸使DNA双链断裂直接损伤细胞。目前，用药物预处理法替代缺血诱导对肝脏的保护作用安全阈大，无需其它特殊仪器设备，便于临床推广和应用[6]。因此，寻找肝缺血再灌注损伤的保护药物便成为肝脏外科研究的热点。本研究通过核黄素预处理大鼠，观察其对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用，为其在肝脏外科领域的研究与应用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1动物

正常健康SD大鼠24只，雌雄不拘，体重268～312 g，购于南京青龙山动物养殖场。

2主要试剂

核黄素购于上海化学试剂采购供应站；丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。DAB显色购于Bio Basic Inc.；血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)兔抗鼠多克隆抗体购于武汉博士德公司；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体购于Sigma。

3动物分组及模型的制备

24只健康SD大鼠随机分为3组：假手术对照组(sham组)、缺血再灌注组(I/R组)、核黄素处理组(R+I/R组)，每组8只，自由进食饮水。Sham组和I/R组大鼠每天喂以正常饲料，R+I/R组大鼠辅以核黄素喂养(40 mg·kg-1·d-1)。喂养4周后，手术前禁食12 h，自由饮水，用戊巴比妥钠(50 mg/kg)经腹腔注射麻醉，取仰卧位固定，腹部皮肤消毒，自剑突开始沿腹白线开腹，游离肝周韧带暴露肝门。Sham组关闭腹腔，I/R组和R+I/R组用无创血管夹阻断肝动脉、门静脉及胆总管，令肝脏进入缺血状态，关闭腹腔。缺血1 h后开腹，松开血管夹恢复血液灌注。肝脏由暗红变为鲜红，即建成肝缺血再灌注损伤动物模型，关闭腹腔。灌注1 h后开腹，各组大鼠均于下腔静脉取血4 mL，1 000×g离心20 min分离血清。同时处死动物，取肝脏一部分置于10%中性甲醛溶液固定；一部分置于-70 ℃冰箱冷冻保存。

4生化指标分析

以全自动生化分析仪检测血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase，ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase，AST)；黄嘌呤氧化酶法检测血清SOD活性；硫代巴比妥酸比色法检测血清MDA含量，严格按照试剂盒说明操作。取冷冻的肝脏组织匀浆并离心分离，取上清测定SOD活性及MDA水平。

5HO-1活性检测

采用Schmidt等[7]的方法进行：取肝组织置于预冷的磷酸钾缓冲液(含2 mmol/L MgCl2和0.1 mmol/L PMSF，pH 7.4) 中匀浆，然后于4 ℃、12 000×g离心20 min。反应总体积1 mL，含大鼠肝组织匀浆液600 μL、氧化型辅酶II 0.8 mmol/L、6- 磷酸葡萄糖1 mmol/L、6-磷酸葡萄糖脱氢酶0.2 U和2.5 mmol/L 氯化高铁血红素10 μL，混匀后，37 ℃振荡水浴避光反应1 h，加0.5 mL 氯仿充分混合终止反应。在464 nm 和530 nm 双波长下检测氯仿层吸光度值，并计算出反应生成的胆红素量。以生成的胆红素量表示HO-1 活性，单位为μmol·h-1·(g protein)-1。

6蛋白印迹分析

取0.2 g肝组织用预冷的PBS洗去血迹，放入匀浆器，加2 mL预冷的组织裂解液及20 μL 0.2 mol/L PSMF异丙醇溶液，匀浆后移至EP管。4 ℃、12 000×g离心20 min，上清液用Bradford法测定蛋白含量。取含同等蛋白量的样本稀释至等体积，每孔上样20 μL，SDS-PAGE电泳分离，用0.22 μm硝酸纤维素膜进行冰浴转膜，结束后取出膜用5%脱脂奶粉TBS-T液于摇床上室温封闭2 h。4 ℃加兔抗鼠HO-1多克隆抗体(1∶500)杂交过夜，TBS-T冲洗，加Ⅱ抗(1∶5 000)室温杂交2 h，洗膜后，DAB显色。以β-actin作为内参照，结果以目的条带和内参比值表示。Quantity One软件分析结果(Bio-Rad)。

7组织病理学分析

取甲醛固定的肝组织石蜡包埋后，切片，苏木素-伊红染色，光学显微镜下观察。

8统计学处理

结 果

1核黄素对生化指标的影响

I/R组大鼠与sham组比较，血清AST和ALT活性、MDA水平明显升高(P<0.01)，SOD活性降低(P<0.01)；R+I/R组大鼠在缺血再灌注后血清AST和ALT活性、MDA水平较I/R组降低(P<0.01)，SOD活性相应升高(P<0.01)，见表1。

2肝组织SOD活性及MDA含量

I/R组大鼠肝组织SOD活性明显低于sham组(P<0.01)，而R+I/R组SOD活性较I/R组则明显升高(P<0.01)；I/R组大鼠肝组织MDA水平明显高于sham组，而R+I/R组则较I/R组明显降低(P<0.01)，见图1。

表1 各组大鼠血清生化学指标的比较

##P<0.01vssham group;**P<0.01vsI/R group.

图1各组大鼠肝组织SOD活性、MDA水平比较

3肝组织HO-1活性

I/R组HO-1酶活性较sham组有所升高(P<0.05)；而与I/R组比，R+I/R组核黄素预处理能导致缺血肝组织HO-1酶活性明显上调(P<0.01)，见图2。

图2各组大鼠肝组织HO-1活性的比较

4蛋白印迹检测肝组织HO-1蛋白表达

蛋白印迹显示R+I/R组可见HO-1蛋白表达信号较强，HO-1/β-actin值均明显高于sham组和I/R组(P<0.01)。I/R组HO-1蛋白表达亦强于sham组(P<0.01)，见图3。

5肝组织病理学分析

光镜下sham组肝细胞形态正常，小叶结构正常，无明显炎症细胞浸润。I/R组肝细胞有细胞肿胀，炎症细胞浸润、小叶结构紊乱；R+I/R组肝细胞亦有轻度细胞肿胀，而几乎无气球样变，小叶结构尚清晰，见图4。

讨 论

缺血再灌注损伤是组织在缺血基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆损伤的1种病理过程。肝缺血再灌注损伤是肝移植、肝切除术及严重肝脏创伤手术等常涉及的共同病理生理变化，其发生机制复杂。大量研究证实，其发生与钙超载、氧自由基损伤、线粒体功能异常、能量物质耗竭等因素相关[8]。在缺血期，白细胞及血小板黏附于内皮细胞导致血管损伤；再灌注使肝窦内皮细胞(sinusoidal endothelial cell，SEC)凋亡，一氧化氮和氧自由基生成增多，激活Kupffer细胞而释放超氧自由基、TNF-α等，进一步加剧氧化损伤[9-10]。氧化与抗氧化的平衡一直是缺血再灌注损伤机制研究的热点。有研究指出活性氧(reactive oxidative species，ROS)和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)在肝脏缺血再灌注损伤中起非常重要的作用。在正常情况下抗氧化系统能够控制ROS和RNS的产生，当氧化应激发生时，ROS和RNS的产生与清除之间的平衡被打破，导致抗氧化系统的衰竭或者氧化物大量产生。此外，还有一些重要保护物质越来越受到大家的重视，如热休克蛋白(heat-shock protein，HSP)的表达、一氧化氮(NO)及一氧化碳(CO)的释放、HO-1活性的增加等[6]。

图3蛋白印迹法检测各组大鼠肝组织HO-1蛋白的表达情况

Figure 4. Hepatic pathology of rats in different groups(HE staining,×400).A: sham group; B: I/R group; C: R+I/R group.

图4各组大鼠肝组织病理结构特点

AST和ALT水平是评价肝功能的常用指标。SOD是细胞内主要的内源性抗氧化酶和氧自由基清除剂，其活性变化可以反映体内的抗氧化能力，MDA是体内最重要的膜脂质过氧化的代谢产物，是衡量组织过氧化损伤程度的指标，可以间接反映细胞损害程度。本实验结果显示， I/R组大鼠血清和肝组织SOD活性显著减弱，同时伴随MDA水平升高，血清AST和ALT升高，提示缺血再灌注后，肝细胞受损，肝功能降低，氧自由基清除能力下降。R+I/R组，再灌注后，血清AST和ALT水平下降，血清和肝组织SOD活性显著升高，MDA水平下降，肝细胞形态学异常改变也较再灌注组明显减轻，提示核黄素预处理可能通过加强大鼠体内抗氧化系统的作用，提高氧自由基清除剂的水平与活力，减轻氧自由基介导的脂质过氧化反应对肝脏的损伤，加速自由基的清除，从而达到对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。

HO-1是血红素降解的起始酶和限速酶，其不仅直接降解血红素，同时还消耗氧和电子，而且能够通过血红素的催化产物，如：CO、胆绿素/胆红素和游离铁等，发挥其细胞保护功能[11]。HO-1是诱导型蛋白，分子量为33 kD， 亦称为热休克蛋白32(HSP32)。它广泛分布于全身组织，以肝、脾内含量最高，在肝脏中HO-1主要以Kupffer细胞所表达。生理情况下，HO-1在组织中呈低水平表达，但热休克、血红素、内毒素、氧化应激等多种因素均可诱导其高表达[12-13]。此外，抗氧化剂亦可通过激活Nrf2途径诱导Kupffer细胞表达HO-1[14]。本研究结果显示，sham组大鼠肝脏检测到HO-l表达较低，I/R组肝组织HO-1表达增强，表明缺血再灌时肝组织损伤加重，可产生氧化应激并诱导HO-1表达。R+I/R组大鼠肝组织HO-1表达较I/R组明显增强，提示核黄素可能通过激活Nrf2途径诱导Kupffer细胞高表达HO-1，从而抑制kuffer细胞的释放反应，减轻细胞因子、趋化因子、炎症介质、活性氧等介导的肝脏缺血再灌住损伤。关于其保护作用的详细机制尚需进一步研究。

综上所述，核黄素可能通过减少氧自由基生成，增强机体抗氧化作用及HO-1的高表达来实现对缺血再灌注肝脏的保护作用。因此，核黄素预处理对肝缺血再灌注损伤的防治可能具有潜在的临床价值。

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Riboflavinpreconditioningalleviateshepaticischemia/reperfusioninjuryinrats

LI Wei, LU Xiao-hua, ZHAO Xue, WANG Guo-guang

(DepartmentofPathophysiology,WannanMedicalCollege,Wuhu241002,China.E-mail:guoguangw1226@sina.com)

AIM: To explore the protective effect of riboflavin preconditioning on hepatic ischemia/reperfusion injury in rats.METHODSTwenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups (n=8): sham group, ischemia/reperfusion (I/R) group and riboflavin preconditioning (R+I/R) group. The rats in sham group and I/R group

a standard chow,while the rats in R+I/R group received a chow supplemented with riboflavin. After 4 weeks, portal vein and hepatic artery supplying the middle and left hepatic lobes were clamped with a traumatic vascular clip for induction of partial hepatic ischemia in the rats in I/R group and R+I/R group. After 1 h of ischemia, 1 h of reperfusion was conducted by removal of the clip. The activity of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in serum,the activity of superoxide dismutase (SOD) and the level of malondialdehyde (MDA) in serum and liver were measured. Western blotting was employed to examine the protein expression of heme oxygenase-1(HO-1) in the liver.RESULTSThe results showed that ischemia/reperfusion injury markedly increased the activity of AST and ALT in serum, decreased the activity of SOD, and elevated the level of MDA and the activity of HO-1 in the liver as compared with sham group (P<0.01). The riboflavin pretreatment significantly decreased the activity of AST and ALT in serum, increased the activity of SOD and decreased the levels of MDA in serum and liver as compared with I/R group (P<0.01). In addition, the protein expression of HO-1 and the activity of HO-1 were elevated in R+I/R group (P<0.01). Cytoplasmic vacuolation and swelling of the hepatocytes were observed in I/R group. Treatment with riboflavin markedly alleviated the changes of liver structure.CONCLUSIONRiboflavin preconditioning has protective effect on hepatic ischemia/reperfusion injury. The mechanism may be correlated with enhancing the anti-oxidation and alleviating the reaction of lipid peroxidation．

Riboflavin; Liver; Ischemia reperfusion; Heme oxygenase-1

R363

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.030