L-carnosine对NIT-1胰岛细胞的影响及机制*

周莉莉， 桂书彦， 杨 雁， 袁 刚

(华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科, 湖北 武汉 430030)

1000-4718(2012)07-1281-06

2012-01-05

2012-04-01

国家自然科学基金资助项目(No.81100582)

△通讯作者 Tel: 027-83663331; E-mail:yuangang88@hotmail.com

L-carnosine对NIT-1胰岛细胞的影响及机制*

周莉莉， 桂书彦， 杨 雁， 袁 刚△

(华中科技大学同济医学院附属同济医院内分泌科, 湖北 武汉 430030)

目的研究肌肽(L-carnosine)对高糖培养的NIT-1细胞胰岛素分泌、增殖和凋亡的影响及机制。方法(1)正常和高糖培养细胞72 h，放射免疫法测定葡萄糖刺激的胰岛素分泌，然后分别换不同浓度葡萄糖和L-carnosine培养，测定胰岛素分泌；(2)细胞分为C组(11.1 mmol/L glucose)、H组 (33.3 mmol/L glucose)、H+A组(33.3 mmol/L glucose +1 mmol/L L-carnosine)和H+B(33.3 mmol/L glucose+ 20 mmol/L L-carnosine)组培养72 h，BrdU检测细胞增殖，流式细胞术检测凋亡，RT-PCR测定bcl-2和caspase-3 mRNA的表达，荧光法检测caspase-3活性。结果(1)高糖组细胞胰岛素分泌减少； 20 mmol/L L-carnosine显著增加正常和高糖组胰岛素分泌(P<0.01)，且呈正相关(P<0.01)；(2)高糖组细胞增殖和凋亡均增加(均P<0.01)，但总体数目减少；1 mmol/L L-carnosine使增殖增加，凋亡减少(P<0.01)；(3) 高糖组caspase-3 mRNA表达明显增加,bcl-2 mRNA明显减少(P<0.05)；1 mmol/L L-carnosine使前者明显减少(P<0.05)，后者明显增加(P<0.01)；不同浓度L-carnosine均明显降低caspase-3活性。结论高浓度L-carnosine可单独刺激细胞分泌胰岛素，低浓度的L-carnosine可增加NIT-1细胞增殖并减少高浓度葡萄糖所导致的凋亡。Caspase-3和Bcl-2可能参与了L-carnosine保护NIT-1细胞的过程。

肌肽; 葡萄糖; 胰岛素; 细胞凋亡; NIT-1细胞

近年来，2型糖尿病发病率逐渐增加，其确切发病机制还不清楚。新近研究显示，肌肽酶1 (carnosinase 1，CN1)与糖尿病及糖尿病肾病明显相关[1]。CN1是一种二肽酶，可以水解β-丙氨酰-L-组氨酸，或称肌肽(L-carnosine)，从而降低L-carnosine的血浆浓度。CN1基因序列上有1个亮氨酸重复序列，研究发现，不同数量的亮氨酸重复序列所表达的CN1的活性不同，亮氨酸重复序列越多，CN1活性越高，同时糖尿病肾病的发病率也越高[2]。大于5个亮氨酸重复序列的病人发生糖尿病肾病的危险性明显增加。由于高活性的CN1可以导致L-carnosine的浓度下降，因此，L-carnosine可能同样与糖尿病有关，并且可能是糖尿病的一种保护因子[3]。Sibylle等[4]研究中，观察到L-carnosine能改善糖尿病实验动物的胰岛素水平，胰腺病理检查提示胰岛体积明显增加,并在细胞实验中观察到一定浓度的L-carnosine可以促进胰岛细胞的增殖，但具体机制不清，推测是否与其影响胰岛细胞增殖和凋亡有关。

在细胞凋亡过程中，caspase-3的激活是凋亡级联反应终末事件，激活后形成的级联反应最终将DNA剪切成寡核苷酸片段，细胞凋亡。而Bcl-2作为一种重要的抗凋亡蛋白发挥着抑制细胞凋亡、保存细胞的作用。

本研究观察L-carnosine在高糖环境中对β细胞以及相关的基因表达的影响，探讨其改善血糖的机制，为其以后的临床应用提供依据。

材 料 和 方 法

1细胞培养

NIT-1细胞(华中科技大学同济医学院免疫学系提供)采用含10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和链霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培养基进行培养。预先使用11.1 mmol/L和33.3 mmol/L葡萄糖培养NIT-1细胞，以模拟高糖环境，然后分别转换成含不同浓度的L-carnosine和葡萄糖的培养基，进行实验。

2细胞分组

分别给予葡萄糖11.1 mmol/L(C组)和33.3 mmol/L(H组)，24孔板预培养72 h。

2.124孔板细胞分别用不同浓度葡萄糖(0 mmol/L、5 mmol/L和25 mmol/L)刺激，放射免疫法测定胰岛素分泌(操作步骤见试剂盒说明书)，检测葡萄糖对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响，以确定细胞具备葡萄糖依赖的胰岛素分泌能力。

2.224孔板细胞分别用含不同浓度葡萄糖和L-carnosine的KRBB液(含0.2%BSA)培养(0 mmol/L glucose+0 mmol/L L-carnosine、0 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine、0 mmol/L glucose+20 mmol/L L-carnosine、5 mmol/L glucose+0 mmol/L L-carnosine、5 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine、5 mmol/L glucose+20 mmol/L L-carnosine、25 mmol/L glucose+0 mmol/L L-carnosine、25 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine和25 mmol/L glucose+20 mmol/L L-carnosine)，收集上清用放射免疫试剂盒测定胰岛素，检测L-carnosine对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响。

3L-carnosine对NIT-1胰岛细胞增殖和凋亡影响

3.1NIT-1细胞分4组 C组：11.1 mmol/L glucose；H组：33.3 mmol/L glucose；H+A组：33.3 mmol/L glucose+1 mmol/L L-carnosine；H+B组：33.3 mmol/L glucose +20 mmol/L L-carnosine，培养72 h。

3.2BrdU测定NIT-1细胞的增殖 24孔板细胞加BrdU(10 μmol/L)培养基，于37 ℃含5% CO2的温箱中孵育30 min；PBS漂洗，70%乙醇于-20 ℃冰箱固定1 h，按罗氏BrdU试剂盒流程操作，最后DAPI复染，荧光显微镜下观察，DAPI标记的细胞核呈蓝色,代表细胞总数，BrdU标记的细胞核呈绿色,代表阳性细胞数，计数1 000个细胞，求出阳性细胞百分率。

3.3流式细胞术(flow cytometry)检测细胞凋亡 12孔板细胞用胰酶消化收集至EP管，离心后PBS混悬细胞，按凯基流式细胞检测流程操作，收集上清于Beckman流式细胞仪分析,凋亡细胞百分数用Annexin Ⅴ+/PI-+ Annexin Ⅴ+/PI+表示。

3.4逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 12孔板细胞提取总RNA,将 mRNA 逆转录为 cDNA， caspase-3(202 bp)引物 5′-TCTGACTGGAAAGCCGAACA-3′和5′-CTGGATGAACCACGACCC-3′。反应条件：94 ℃ 2 min热启动,94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min，循环33次。bcl-2(190 bp)引物5′-ATGCGTCCACCAAGAA-3′和5′-GTAGAAGAGGGCACCAC-3′。 反应条件：94 ℃ 2 min热启动,94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min，循环35次。β-actin(216 bp)引物5′-GAAATCGTGCGTGACATCAAAG-3′和5′- TGTAGTTTCATGGATGCCACAG- 3′。反应条件：94 ℃ 2 min热启动,94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s,72 ℃ 10 min，循环30次。扩增产物1.5%琼脂糖凝胶电泳 ,置于凝胶成像系统灰度扫描(UVP) ,以β- actin作为内参照校正。

3.5Caspase-3活性检测 12孔板细胞用胰酶消化收集至EP管，离心后PBS洗涤2次，使用荧光法caspase-3活性检测试剂盒(Biovision)，按照说明操作，酶标仪测定405 nm处吸光度(A)值。

4统计学处理

结 果

1L-carnosine对胰岛素分泌的影响

使用11.1 mmol/L和33.3 mmol/L葡萄糖预培养的NIT-1细胞均显示葡萄糖浓度依赖的胰岛素释放,见图1A。但是与对照组相比，高糖组胰岛素分泌明显降低，提示NIT-1细胞具备胰岛细胞胰岛素分泌特征，长时间高浓度葡萄糖培养降低NIT-1细胞的胰岛素分泌。

在无糖条件下(0 mmol/L葡萄糖)，无论11.1 mmol/L或33.3 mmol/L葡萄糖预培养细胞，与无L- carnosine刺激组比较，20 mmol/L L-carnosine均显著增加胰岛素分泌(P<0.01)，而在1 mmol/L L- carnosine组，胰岛素分泌稍有增加，但无明显差异(P>0.05),见图1B、C；在11.1 mmol/L葡萄糖预培养组中，20 mmol/L L-carnosine 与1 mmol/L L-carnosine比较，胰岛素分泌无显著差异(P>0.05),见图1B;而在33.3 mmol/L葡萄糖预培养组中, 20 mmol/L L-carnosine与1 mmol/L组比较明显增加胰岛素分泌(P<0.01)，见图1C；在有糖条件(5 mmol/L和25 mmol/L)下，无论用正常或高浓度葡萄糖预先培养的细胞，1 mmol/L和20 mmol/L L-carnosine均不明显增加胰岛素分泌(P>0.05)，见图1B、C。

2L-carnosine对NIT-1细胞增殖和凋亡的影响

2.1BrdU检测NIT-1细胞增殖率 图2显示,高糖干预组细胞增殖率较正常组明显增加(36.22%vs18.32%,P<0.01)，1 mmol/L L-carnosine培养使增殖率继续增加至43.87%(P<0.01)， 而20 mmol/L L-carnosine并不继续增加增殖率，与H组比较也不明显增加(P>0.05)。

图1L-carnosine对NIT-1细胞胰岛素分泌的影响

图2L-carnosine对NIT-1细胞增殖的影响

2.2AnnexinⅤ-FITC/PI检测细胞凋亡 图3显示,AnenexinⅤ-/PI-为正常细胞，AnenexinⅤ+/PI-为早期凋亡细胞，AnenexinⅤ+/PI+为晚期凋亡细胞，AnenexinⅤ-/PI+为坏死细胞；AnenexinⅤ+/PI-与AnenexinⅤ+/PI+为总的凋亡细胞。高糖组细胞凋亡率为25.19%，明显高于对照组的6.42%(P<0.01)，且高糖培养后细胞凋亡占优势，总体数量减少；1 mmol/L和20 mmol/L L-carnosine均使细胞凋亡减少(P<0.01)，且1 mmol/L L-carnosine能使细胞凋亡减少更低。

图3L-carnosine对NIT-1细胞凋亡的影响

2.3RT-PCR检测caspase-3和bcl-2 mRNA的表达 图4显示，高糖组caspase-3 mRNA表达明显增加,bcl-2 mRNA表达明显减少(P<0.05)；

图4半定量RT-PCR测定bcl-2和caspase-3mRNA的表达

1 mmol/L L-carnosine使前者明显减少(P<0.05)，后者明显增加(P<0.01)。20 mmol/L L-carnosine对两者无明显影响(P>0.05)。

2.4Caspase-3活性检测 图5显示，高糖组caspase-3活性较对照组明显增加，1 mmol/L和20 mmol/L L-carnosine均明显降低caspase-3活性。

图5L-carnosine对NIT-1细胞caspase-3活性的影响

讨 论

Hihiko等[5]发现了鸡精的一种有效成分为L-carnosine对糖尿病有利，进行了一项对大鼠无麻醉条件下的腹腔注射2-脱氧-D-葡萄糖的实验，造成体内血糖升高，而头颅和腹腔内分别注射L-carnosine均能减少这种高血糖状态。L-carnosine广泛存在于机体组织的细胞内，在肌肉和中枢神经系统表达最高，分别分泌进入血液和脑脊液。在人体内，L-carnosine被由肝脏所分泌的CN1所降解。在包括啮齿类在内的其它哺乳动物，CN1主要在肾脏表达，血浆中水平很低，L-carnosine由肾小球滤过并由肾小管重吸收，在细胞浆中降解。研究显示，L-carnosine具有清除活性氧[6]、抑制脂质氧化[7]、防止蛋白质糖化[8]、调节免疫功能[9]以及抗肿瘤[10]和抗衰老等作用[11]。Sauerhöfer等[4]观察到L-carnosine能改善实验动物的血糖，增加胰岛素水平，胰腺病理检查提示胰岛体积明显增加，但是具体机制不清，推测L-carnosine对血糖的影响可能是通过刺激胰岛细胞产生胰岛素或者增加胰岛细胞的增殖来实现的。

NOD鼠是广泛应用于糖尿病基础研究的胰岛素依赖性糖尿病模型，通过转基因技术导入SV40大T抗原基因后能自发性产生胰岛β细胞瘤，NIT-1细胞就是源于这种转基因NODdx鼠的β细胞[12]。NIT-1细胞为多边形上皮样细胞，呈簇状生长，基本保持了小鼠正常胰岛β形态。免疫化学实验证实，NIT-1细胞主要分泌胰岛素，只有极少部分的(≤0.5%)细胞分泌胰高血糖素，其胰岛素的基础分泌情况与正常胰岛β细胞没有显著差异。因此，可用NIT-1细胞替代小鼠正常胰岛β细胞进行胰岛素依赖性糖尿病的基础研究。

本实验使用NIT-1细胞，研究L-carnosine影响糖尿病的可能机制。对正常和高糖培养的NIT-1细胞进行了不同刺激物下的胰岛素分泌实验，发现随着用于刺激的葡萄糖浓度的增加，NIT-1细胞胰岛素释放增加，呈剂量依赖性，说明NIT-1细胞符合胰岛β细胞的特征，可以用于实验。同时发现高糖孵育72 h后，细胞分泌胰岛素整体水平均减少，说明高糖使胰岛β细胞功能受损；另外观察到高浓度L-carnosine能单独刺激胰岛素分泌，但接近生理浓度时并没有明显影响胰岛素分泌，且在葡萄糖存在的条件下不同浓度L-carnosine对胰岛β细胞分泌胰岛素没有明显增加，说明高浓度L-carnosine虽然能够增加胰岛素分泌，但此种促分泌作用不能解释其改善糖尿病大鼠血糖的机制，应该还存在其它方面的机制。

胰岛素的分泌能力取决于胰岛β细胞合适的数量，这是由β细胞增殖/坏死和凋亡之间动态的平衡决定[13]。既往研究显示长期高血糖的毒性作用，使β细胞增殖呈一过性增加而凋亡逐渐增加，当增殖的增加不足于代偿细胞的凋亡，即发生β细胞的丢失[14]。因此我们进一步研究了L-carnosine对NIT-1细胞增殖和凋亡的影响。结果显示NIT-1细胞在慢性高糖作用下，增殖率和凋亡率均明显增加，但是凋亡超过增殖，说明胰岛细胞仍处于负增殖状态，细胞数量总体上有所减少；生理浓度和高浓度的L-carnosine均明显增加β细胞增殖，但生理浓度L-carnosine增加更明显，且高于单独高血糖的影响。同时各浓度L-carnosine均明显减少NIT-1细胞的凋亡，说明L-carnosine使细胞处于正增殖状态，从而增加β细胞的数量，进一步改善胰岛功能，并且此种作用在生理剂量L-carnosine组更明显。

高血糖的大鼠模型中观察到了抗凋亡基因bcl-2的减少和促凋亡基因bax的增加，它们是启动凋亡过程的执行者,前者和后者的比值决定了细胞是否凋亡[15]。Caspase-3的激活是凋亡级联反应终末事件，激活后形成的级联反应最终将DNA剪切成寡核苷酸片段。为了观察这2种基因是否也参与了L-carnosine改善胰岛细胞增殖和凋亡的过程，我们分别测定不同组别中两者的表达量，结果显示高糖组caspase-3表达和活性较对照组增加(P<0.05)，抗凋亡基因bcl-2活性则下降(P<0.05)；与高糖组H相比，生理浓度的L-carnosine(1mmol/L)能抑制凋亡蛋白caspase-3 mRNA的表达和活性(P<0.01)，增加抗凋亡蛋白bcl-2 mRNA的表达(P<0.05)，说明caspase-3和Bcl-2可能参与了高糖条件促进NIT-1细胞增殖和凋亡的调节，以及L-carnosine可能通过对caspase-3和Bcl-2的影响来调节β细胞的增殖和凋亡。但具体机制还需要进一步的研究。

新近研究[16]显示L-carnosine也可通过增加肝脏糖原合成酶2、葡萄糖激酶和葡萄糖转运子2的表达来调节葡萄糖代谢，提示L-carnosine对糖尿病还存在胰岛外的作用。并且L-carnosine还可能抑制糖基化终末产物的形成，从而改善糖尿病的慢性并发症如糖尿病肾病[17]和视网膜病变等[18]。

L-carnosine基本组成成分为丙氨酸和组氨酸，另有研究发现丙氨酸能有效地刺激胰岛细胞分泌胰岛素，其作用可能是协同葡萄糖的代谢或在自身代谢过程中产生促分泌偶联因子如谷氨酸等[19]，这些可能也参与L-carnosine对糖尿病的影响。

综上所述，本研究发现，高浓度L-carnosine能直接刺激β细胞胰岛素分泌，但其作用小于葡萄糖的刺激作用；同时L-carnosine能增加胰岛细胞的增殖，减少高血糖所导致的凋亡，增加胰岛细胞的数量，其机制可能部分为影响Bcl-2及caspase-3表达。

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EffectsofL-carnosineonNIT-1isletcells

ZHOU Li-li, GUI Shu-yan, YANG Yan, YUAN Gang

(DepartmentofEndocrinology,TongjiHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScience&Technology,Wuhan430030,China.E-mail:yuangang88@hotmail.com)

AIM: To investigate the protective effect of L-carnosine on insulin secretion, proliferation and apoptosis of β-cells impaired by high glucose.METHODSNIT-1 cells were pre-treated with glucose at concentrations of 11.1 mmol/L (control level) and 33.3 mmol/L (high level) for 72 h, and then the cells were stimulated with various concentrations of glucose (0, 5 and 25 mmol/L) and/or L-carnosine (0, 1 and 20 mmol/L). The level of insulin in the medium was measured by radioimmunoassay. To detect the effect of L-carnosine on proliferation and apoptosis, NIT-1 cells were divided into 4 groups according to different culture conditions for 72 h: group C (with 11.1 mmol/L glucose), group H (with 33.3 mmol/L glucose), group H+A (with 33.3 mmol/L glucose+ 1 mmol/L L-carnosine) and group H+B (with 33.3 mmol/L glucose +20 mmol/L L-carnosine). Proliferous or apoptotic cells were identified by BrdU labeling and flow cytometry (labeling with annexin V-FITC/PI),respectively. Total RNA was extracted and the mRNA expression of caspase-3 and bcl-2 was measured by RT-PCR. The caspase-3 activity was also checked by fluorometric assay kit.RESULTSThe insulin in high-level glucose group was lower than that in control-level glucose group. L-carnosine at concentration of 20 mmol/L notably increased the insulin secretion of the cells pre-treated with glucose at control level or high level. The proliferation and apoptosis were both increased in group H compared with group C, but the total cell counts declined because the apoptotic rate was higher than the proliferation rate. L-carnosine at concentration of 1 mmol/L significantly increased the proliferation rate and decreased the apoptotic rate. The mRNA level of caspase-3 was decreased and the mRNA level of bcl-2 was increased after the cells were treated with L-carnosine at concentration of 1 mmol/L. L-carnosine at concentrations of both 1 mmol/L and 20 mmol/L significantly decreased the caspase-3 activity.CONCLUSIONL-carnosine at high level directly stimulates insulin secretion in NIT-1 cells, and L-carnosine at normal level promotes the cell proliferation and inhibits apoptosis induced by high concentration of glucose. Caspsase-3 and Bcl-2 may be partly involved in this process.

Carnosine; Glucose; Insulin; Apoptosis; NIT-1 cells

R587.1

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2012.07.024