银杏叶提取物对肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP－1 m RNA、MMP－1m RNA表达的影响

华彩成 万远太

银杏叶提取物(ginkgo biloba extract，GbE)是从银杏叶中分离纯化而提取的一种药物，既往在临床中多用于治疗心、脑血管疾病及癌症等［1，2］。近些年来，此药物已在较多动物实验和临床应用中证明具有抗肝纤维化的作用［3，4］。本研究拟观察GbE对肝纤维化大鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TIMP－1 mRNA、MMP－1mRNA表达的影响，并探讨其抗肝纤维化的作用机制。

材料与方法

1．实验动物:雄性Wistar大鼠30只，普通级，体重180±40g，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心。

2．实验试剂及药物:GbE购自西安中鑫生物技术有限公司，CCl4购自北京精细化工厂，Ⅰ、Ⅲ型胶原抗体购自北京中山生物技术有限公司，二抗、DAB显色试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司，反转录酶、Taq酶、dNTP均为Promega公司生产。TIMP－1及MMP－1上下游引物由上海博亚公司合成。

3．实验分组和处理:实验大鼠随机分为3组，每组各10只。模型组:40%CCl4溶液背部皮下注射，注射剂量0．3ml/100g，2次/周，共注射8周，同时予以治疗组灌胃相同剂量生理盐水处理;治疗组:造模方法同模型组，同时给予银杏叶提取物悬浊液灌胃，剂量3g/100g，1次/天，共灌胃8周;对照组，给予等量生理盐水背部皮下注射，并予以相同剂量生理盐水灌胃处理8周。

4．常规病理学检查:8周后处死全部大鼠，取部分肝脏组织在4%多聚甲醛溶液固定处理24h，石蜡包埋，连续切片，切片厚度为4μm，常规做HE染色，在光镜下行常规病理学检查，按相关标准判断肝纤维化程度分级(0～Ⅳ级)［5］。

5．免疫组织化学染色:采用免疫组织化学染色方法半定量检测各组肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平。Ⅰ、Ⅲ型胶原实验浓度为1∶100，均设有空白对照(磷酸盐缓冲液)和阴性对照(正常兔血清)。以细胞质、膜或间质等部位出现棕黄色颗粒或线状沉积为表达阳性。采用免疫组化图像分析软件在低倍镜下计算阳性面积百分比(%)，每张切片随机选取5个视野，取其平均值。

6．RT－PCR方法:称取每只大鼠50～100mg重量的肝组织，Trizol提取液提取肝脏组织总RNA，测定A260/A280值。取2μg总RNA，42℃温度下反转录处理90min。PCR条件为:95℃变性 40s，52℃退火 40s，74℃延伸 60s，共 30 个循环，最后74℃彻底延伸7min。内参照GAPDH PCR方法相同。取5μl体积的PCR产物2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶图像分析系统检测其PCR条带灰度，TIMP－1/GAPDH及MMP－1/GAPDH比值依次表示TIMP－1 mRNA和MMP－1 mRNA的相对表达水平。引物序列见下:TIMP－1(393bp)，上游引物:5'－CATGGAGAGCCTCTGTGGAT－3'，下游引物:5'－GTTCAGGCTTCAGCTTTTGC－3';MMP－1(649bp)，上游引物:5'－TCAGTTCGTCCTCACTCCAG－3'，下游引物:5'－TTGGTCCACCTGTCATCTTC－3';GAPDH(300bp)，上游引物:5'－GAGGACCAGGTTGTCTCCTG－3'，下游引物:5'－GGATGGAATTGTGAGGGAGA －3'。

7．统计学方法:SPSS 10．0统计软件进行数据分析，采用t检验，以P＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．肝脏组织常规病理学检查:各组大鼠肝组织行HE染色，普通显微镜下观察，可见模型组门管区纤维结缔组织增生明显，肝小叶分界清楚，被纤维间隔分隔，有假小叶形成;治疗组可见纤维程度较轻，肝小叶结构基本正常，细胞气球样变仍明显，无假小叶和纤维间隔组织结构形成。肝纤维化程度分级可知模型组肝纤维化程度明显高于治疗组(表1及图1)。

表1 各组肝纤维化程度分级

图1 各组大鼠肝组织HE染色(×200)

2．Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况:模型组及治疗组肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P＜0．01);经GbE灌胃处理后，治疗组肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平明显低于模型组(P＜0．01，表2 及图2)。

表2 各组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达情况(%)

3．TIMP－1 mRNA和MMP－1mRNA表达情况:模型组及治疗组肝脏组织TIMP－1 mRNA、MMP－1 mRNA表达水平较对照组均显著增高(P＜0．01)，且治疗组TIMP－1 mRNA表达水平明显低于模型组(P＜0．01)，治疗组MMP－1 mRNA表达水平明显高于模型组(P ＜0．01，表3)。

讨 论

肝脏组织纤维化是慢性肝病共同的病理过程，其主要是各种致病因素导致肝脏出现慢性损伤，细胞外基质(ECM)合成量明显增多和(或)降解明显减少，从而使得ECM尤其Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原在肝组织中过度增生和沉积最终造成的病理性结果［6］。已有大量研究结果表明某些条件下肝纤维化可发生逆转，但目前临床治疗方面仍缺乏疗效显著的抗纤维化药物［7］。

表3 各组TIMP－1 m RNA和MMP－1 m RNA表达情况

GbE主要药理成分为黄酮甙，该分子中含有一种具有还原性羟基功能的基团，可捕捉各种类型的自由基，其作用机制是对上述自由基发挥氢原子供体的药理性作用，进而终止细胞内自由基的连锁反应链，避免引起氧自由基和脂质过氧化等反应的加剧，最终减轻氧自由基和脂质过氧化所导致的损害严重程度［8～10］。此外还有相关研究发现，GbE具有保护肝窦状内皮细胞的药理作用，可明显改善因慢性肝脏组织受到损伤后所产生的微循环紊乱状态［11］。因此笔者推测GbE对CCl4所致肝纤维化大鼠具有一定的保护作用。

本研究采用CCl4制作肝纤维化大鼠模型，同时予以GbE进行干预，结果显示，造模8周后模型组大鼠肝脏组织观察可见有大量胶原纤维沉积于汇管区，有假小叶出现，证实肝纤维化模型成功建立。治疗组予以GbE处理后，可见肝小叶结构基本正常，虽然仍存在细胞气球样变，但未发现明显假小叶和纤维间隔组织结构形成。肝纤维化程度分级结果也显示，治疗组肝脏纤维化程度较模型组明显减轻。免疫组化染色结果显示，对照组和治疗组Ⅰ、Ⅲ型胶原仅在汇管区有所表达，而模型组中，除汇管区外Ⅰ、Ⅲ型胶原主要弥漫性分布在肝纤维隔内，经GbE灌胃处理后，治疗组肝脏组织Ⅰ、Ⅲ型胶原表达水平明显低于模型组(P＜0．01)。上述结果证实GbE对CCl4所致肝纤维化具有明显的防治作用，可明显减轻Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝脏组织中的大量沉积。

国内外研究发现肝纤维化的实质是ECM合成与代谢失衡，ECM合成过多或降解减少而在肝内过度沉积引起的，主要是Ⅰ、Ⅲ型胶原的沉积。在肝内参与ECM降解的主要是基质金属蛋白酶(MMPs)，其中间质胶原酶(MMP－1)在降解肝纤维化肝脏ECM的主要成分－Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解过程中起重要作用，而对MMP－1的活性起重要作用是基质金属蛋白酶组织抑制因子 －1(TIMP－1)，TIPM－1通过MMPS(主要是MMP－1)的活性的抑制促进肝纤维化的形成和发展［12］。正常生理状态下，MMPs与TIMPs处于一种动态平衡状态，共同调节肝脏组织中ECM的生成和降解过程，并维持ECM的稳定状态。而在病理状态下，MMPs和TIMPs之间失去平衡，从而导致Ⅰ、Ⅲ型胶原在肝脏组织内出现过度沉积现象，最终引起肝纤维化［13］。

本研究结果显示模型组及治疗组肝脏组织TIMP－1 mRNA、MMP－1 mRNA表达水平较对照组均显著增高(P＜0．01)，且治疗组TIMP－1 mRNA表达水平明显低于模型组(P＜0．01)，治疗组MMP－1 mRNA表达水平明显高于模型组(P＜0．01)。结果提示，GbE可通过提高MMP－1表达和抑制TIMP－1表达的作用。

综上所述，抑制TIMP－1表达和增强MMP－1表达并进一步促进Ⅰ、Ⅲ型胶原的降解是GbE抗肝纤维化的作用机制之一。本研究为GbE应用于肝纤维化的临床防治提供了理论依据。

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3 罗燕军，于皆平，罗和生，等．银杏叶提取物对四氯化碳诱发大鼠肝纤维化的预防作用［J］．中华消化杂志，2004，24(5):307－309

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