林蛙皮胶原蛋白肽的制备工艺

王长周，邱芳萍，房天琪，季晓峰

（长春工业大学功能食品与生物技术研究所，吉林长春130012）

林蛙皮胶原蛋白肽的制备工艺

王长周，邱芳萍*，房天琪，季晓峰

（长春工业大学功能食品与生物技术研究所，吉林长春130012）

以长白山林蛙皮为原料，选用碱性蛋白酶，对酶解温度、酶解时间、加酶量、pH、料液比五个因素来研究，经实验确定最佳酶解条件为：酶解温度50℃，加酶量0.5%，酶解时间3h，pH9.0，料液比1∶3（g/mL），脱色脱腥处理后，喷雾干燥制得微黄色粉末状林蛙皮胶原蛋白肽。结果表明，羟脯氨酸含量为20.69μg/mL，分子量分布在3.5ku以下。

林蛙皮，胶原蛋白肽，制备，工艺

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

林蛙皮 来自长白山林蛙，又名东北林蛙，拉丁文为Rana chensinensis；氯胺T、对二甲氨基苯甲醛天津市光复精细化工研究所；二水合氯化亚锡 西陇化工股份有限公司；4-羟基-L-脯氨酸 国药集团化学试剂有限公司；丙烯酰胺 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；甲叉双丙烯酰胺 上海惠世生化试剂有限公司；超低分子量蛋白质Marker 上海雷浩信息科技有限公司；碱性蛋白酶 南宁东恒华道生物科技有限责任公司，酶活力20万u/g；其他均为分析纯试剂。

TDZ5-WS多管架自动平衡离心机 湖南赛特湘仪离心机仪器有限公司；YC-015实验型喷雾干燥机 上海雅程仪器设备有限公司；UV1102紫外分光光度计 上海棱普仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 操作方法 将干林蛙皮在清水中浸泡24h，按比例加入清水，并调节pH，加入一定量的碱性蛋白酶进行酶解，对酶解液100℃10min灭酶活，加0.3%活性炭，于50℃作用50min，pH维持在5.5左右[2]，过滤，离心后取上清液，浓缩，喷雾干燥制得林蛙皮胶原蛋白肽。

1.2.2 正交实验设计 为了确定酶解温度、酶解时间、加酶量、pH、料液比对水解度的影响效果，在单因素实验研究的基础上，设计了五因素四水平的正交实验，对酶解工艺进行优化。正交实验设计见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Design table of orthogonal experiment

1.3 检测方法

1.3.1 水解度测定 采用游离氨基氮甲醛快速滴定法[3]测定林蛙皮的水解度。

1.3.2 羟脯氨酸含量测定 根据对二甲氨基苯甲醛比色法[4]测定羟脯氨酸含量，从而推算出林蛙皮胶原蛋白的含量。

1.3.3 分子量测定 利用聚丙烯酰胺凝胶电泳[5-7]测定所得林蛙皮胶原蛋白肽的分子量。

2 结果与讨论

2.1 林蛙皮胶原蛋白肽提取工艺正交实验数据分析

正交实验结果及方差分析见表2~表3。

表2 正交实验结果及分析Table 2 Orthogonal experiment results and analysis

由表2正交实验结果及分析表明，影响水解度的主次因素为A>C>B>E>D，最佳酶解工艺为A3B3C2D3E3，即酶解温度50℃，酶解时间3h，加酶量0.5%，pH9.0，料液比1∶3，在此条件下水解度最高，达到6.75%。

表3 水解度方差分析Table 3 Variance analysis for hydrolysis degree

2.2 羟脯氨酸含量结果分析

根据GB 9695.23-2008，羟脯氨酸含量测定所提供的方法，绘制出羟脯氨酸标准曲线，见图1。

图1 羟脯氨酸标准曲线Fig.1 Hydroxyproline standard curve

经实验测得：产物中羟脯氨酸含量为20.69μg/mL，转换成胶原蛋白的含量为44.86%。

2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果分析

选择适合小分子胶原蛋白肽的电泳凝胶：分离胶（T=20%，C=2.9%），浓缩胶（T=4.8%，C=2.9%），进行聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。电泳结果见图2。

图2 聚丙烯酰胺凝胶电泳结果Fig.2 Polyacrylamide gel electrophoresis results

电泳结果表明，该林蛙皮胶原蛋白肽的分子量分布较好，均在3.5ku以下，多肽含量较高。

3 结论

本研究选用碱性蛋白酶对长白山林蛙皮进行水解，来制备林蛙皮胶原蛋白肽，其主要特点：a.采用单一酶水解，成本降低，适合于工业化生产；b.水解率高，蛙皮转化率达到80%以上；c.利用该工艺制备的胶原蛋白含量较高，可达44.86%，含有甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、精氨酸等二十多种氨基酸，且生物活性肽含量较高；d.经聚丙烯酰胺凝胶电泳测得其分子量在3.5ku以下，证明该胶原蛋白为胶原蛋白肽。该胶原蛋白肽可以作为天然的保健食品和化妆品的原料，具有重要的应用价值和较大的开发潜力。

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Preparation process for rana skin collagen peptide

WANG Chang-zhou，QIU Fang-ping*，FANG Tian-qi，JI Xiao-feng
（Research Laboratory of Functional Food and Biotechnology，Changchun University of Technology，Changchun 130012，China）

The rana skin was used as a raw material.Alkali protease were chosen and the influences of the five process parameters which were enzyme solution temperature，enzymatic hydrolysis time，plus enzyme quantity，pH and liquid materials were studied.According to the experiment，the optimal media conditions were 50℃temperature zymolysing，adding enzyme quantity 0.5%，zymolysing time 3h，pH9.0，1∶3 liquid to material rate（g/mL）. After decoloring and deodorization processing，yellowish powder rana skin collagen peptide was got through spray drying.The results showed that hydroxyproline content was 20.69μg/mL and molecular weight was under 3.5ku.

rana skin；collagen peptide；preparation；process

TS201.1

B

1002-0306（2012）07-0309-03

长白山林蛙是我国东北地区长白山末麓集药、食、补于一体的珍贵蛙种，由于近年来人工养殖技术的成熟和完善，其资源十分丰富。作为一种高价值的药用动物，长白山林蛙在食品、药品、化妆品、保健品等方面有着广泛的应用。林蛙皮是摘取林蛙油后作为饲料或废弃物的物质。本研究立足于长白山林蛙资源丰富以及蛙皮中含有大量生物活性物质这一优势，重点研究了林蛙皮胶原蛋白肽的制备工艺，用于开发保健品和化妆品的原料，以此提高长白山林蛙的综合利用价值。有资料报道：胶原蛋白肽可以被人体主动且无障碍吸收[1]，能有效增强人体皮肤组织细胞的储水能力，使肌肤富于弹性，柔软而细嫩；可促进骨的形成，增强低钙水平下的骨胶原结构，从而提高骨强度，达到预防骨质疏松症的作用。本研究采用单一酶法水解林蛙皮，优化了酶解工艺参数，建立最佳的林蛙水解工艺，使其水解率保持在80%以上，原料低廉、工艺简单、利用率高，大大提高了林蛙皮的使用价值，对长白山林蛙资源的合理开发利用有着重大意义。

2011－07－11 *通讯联系人

王长周（1985-），男，研究生，研究方向：生物技术与食品科学。

吉林省中小企业创新基金项目（20106042）。