山茱萸籽总黄酮的响应曲面法优化微波辅助提取工艺的研究

刘瑞林，詹汉英，张志琪

（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，陕西西安710062）

山茱萸籽总黄酮的响应曲面法优化微波辅助提取工艺的研究

刘瑞林，詹汉英，张志琪*

（药用资源与天然药物化学教育部重点实验室，陕西师范大学化学化工学院，陕西西安710062）

目的：利用微波辅助提取技术对山茱萸籽总黄酮的提取工艺进行研究。方法：以芦丁为对照品，采用紫外-分光光度法测定山茱萸籽中总黄酮的含量，以总黄酮含量为考察指标，采用响应曲面优化法（RSM）优化山茱萸籽总黄酮的提取工艺。结果：优化的山茱萸籽总黄酮微波辅助提取工艺参数为：微波功率350W，乙醇体积分数50%，液料比20mL/g，提取时间13min。在此最佳条件下，山茱萸籽总黄酮的一次提取率为6.68%。结论：山茱萸籽含有较高的总黄酮含量，所确定的提取工艺提取率高、速度快、操作简便。

微波辅助提取，山茱萸籽，总黄酮，响应曲面法（RSM）

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

山茱萸果核 购于西安百姓大药房，水分含量0.3%，产地为河南；芦丁 天津一方科技有限公司，含量＞99%；亚硝酸钠、氢氧化钠、硝酸铝、石油醚、无水乙醇 均为分析纯。

FW400A高速万能粉碎机 北京科伟永兴仪器有限公司；XO-SM200超声微波组合反应系统 南京先欧仪器制造有限公司；RE-52A旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FA电子分析天平 上海恒平科学仪器有限公司；ZK-82A电热真空干燥箱 上海实验仪器厂有限公司；TU-1900双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品预处理 将山茱萸籽粉碎后过60目筛，精确称取10g样品装入滤纸筒中，封口处加少许脱脂棉，细线扎紧，置于索氏浸提管内，高度不超过虹吸管，以无水乙醚为脱脂剂，于45℃水浴锅中脱脂20h，充分除去样品中脂类和脂溶性色素后，将滤纸包取出，先用电吹风吹干，再置烘箱中60℃烘2h备用。

1.2.2 山茱萸籽总黄酮提取工艺流程 山茱萸籽脱脂粉末→乙醇浸提回流→抽滤得滤液→定容→测定溶液吸光度

1.2.3 提取实验设计 本实验在单因素实验结果基础上，选取微波功率、乙醇体积分数、液料比以及提取时间4个主要影响山茱萸籽总黄酮提取率的因素，每个因素选取高、中、低三个水平，各实验组的编码与取值见表1，共27个实验点，其中24个为析因点，3个为零点，零点实验进行3次，作误差估计。按照响应曲面法中的Box-Behnken设计方案（表2），依次进行实验，以山茱萸籽总黄酮提取率（Y）为响应值，对实验结果进行分析，建立二次多项式数学模型：

其中，Y为山茱萸籽总黄酮提取率预测响应值，Xi和Xj为自变量，β0为常数项，βi为线性系数，βij为交互项系数，βii为二次项系数。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Variables and levels of the three-variable，three-level Box-Behnken design

1.2.4 标准曲线的制作 精确称取芦丁标准品20.0mg，用质量分数75%的乙醇溶液于100mL容量瓶中定容。准确吸取标准品溶液0.0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、3.0、4.0mL于10mL棕色容量瓶中，分别加入0.4mL质量分数为5%的NaNO2溶液，摇匀、放置6min后加入0.4mL质量分数10%的Al（NO3）3溶液，摇匀静置6min后加入4mL质量分数4%的NaOH溶液，放置15min，用75%乙醇稀释至刻度，10min后以75%乙醇为空白，在200~700nm扫描，考察最大吸收波长范围，并在最大吸收波长下分别测定不同浓度的芦丁的吸光度，平行实验三次。以吸光度为纵坐标，总黄酮含量为横坐标，绘制标准曲线。

1.2.5 山茱萸籽总黄酮提取 精密称取脱脂山茱萸籽粉约5.0g，置于250mL反应瓶中，加入一定比例体积分数的乙醇提取溶剂，按照图1所示，连接好回流装置，按照响应曲面法中的Box-Behnken设计方案进行实验（表2），按所设计的不同实验条件提取山茱萸籽总黄酮，并回流冷凝，过滤洗涤得滤液，滤液浓缩定容于250mL容量瓶中。精密吸取0.5mL该试液于10mL容量瓶中，按照标准曲线制备方法在最大吸收波长处测定其吸光度，并计算总黄酮的含量。

图1 山茱萸籽总黄酮的微波辅助提取装置Fig.1 The Cornus officinalis seed total flavonoids microwave-assisted extraction device

1.2.6 样品的测定 采用硝酸铝-亚硝酸钠-氢氧化钠法[8]，准确移取0.5mL供试样品溶液，置于10mL棕色容量瓶中，按上述1.2.4方法测定。以试剂空白作参比，根据标准曲线计算样液总黄酮提取率。

总黄酮提取率（%）=2m1/（m总×103）×100%

2 结果与讨论

2.1 最大吸收波长的确定

按照1.2.4的方法，在200~700nm波长处对芦丁标准溶液进行紫外光谱扫描，得到如图2的扫描图，结果发现最大吸收波长约为510nm。

图2 芦丁的紫外吸收光谱Fig.2 The rutin UV absorption spectrum

2.2 标准曲线的制作及其回归方程

以芦丁标准溶液的浓度（mg/mL）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制芦丁标准曲线（见图3），并进行线性回归，得回归方程为：y=11.094x+0.02，其中：x为芦丁溶液浓度，y为吸光度；R2=0.9995，线性范围为0.004~0.08mg/mL，其线性关系良好。

2.3 响应曲面实验结果与分析

2.3.1 回归模型方程的建立及显著性检验 根据响应曲面法Box-Benhnken设计（BBD），共27个实验点进行实验，山茱萸籽总黄酮的提取率见表2。使用Design-expert software 7.1.3 Trial（State-Ease Inc.，Minneapolis，MN，USA）软件进行数据分析，以山茱萸籽总黄酮的提取率为响应值，得到的多元二次回归模型方程为：

图3 芦丁标准曲线Fig.3 Rutin standard curve

表2 BBD实验设计和实验结果Table 2 Box-Behnken design and observed responses

该模型的回归分析见表3。根据模型的P<0.05，F模型= 70.52＞F0.05（14.3）=8.71，说明实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性；失拟项用来检测回归模型与实际实验值拟合程度的好坏，如果失拟项显著，说明对响应值有影响的还有其它因素。总黄酮提取率的失拟项P=0.1118＞0.05，表明失拟不显著。由此可见，该模型能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该回归方程确定最佳提取工艺条件。该回归模型的调整确定系数为R2Adj=0.9740，即该模型能解释97.40%响应值的变化，模型拟合程度良好，实验误差小，说明应用响应曲面法优化山茱萸籽总黄酮的提取模型条件是可行的。此外，还可以明显看出，X1、X2、X3、X4、X1X3、X1X4、X2X3、X12、X22、X32和X42具有统计学意义（P<0.05），即微波功率、乙醇体积分数、液料比、提取时间的一次项，微波功率与液料比的交互项、微波功率与提取时间的交互项、乙醇体积分数与液料比的交互项，微波功率、乙醇体积分数、液料比、提取时间的二次项均对山茱萸种籽总黄酮的提取率有显著影响。

表3 拟合回归方程的方差分析结果Table 3 Analysis result of variance（ANOVA）for the fitted quadratic polynomial model

2.3.2 响应曲面分析 根据模型方程绘制响应曲面图、标准残差图及模型预测值/实验值拟合曲线图，结果见图4（A-H）。从响应曲面图中可以明显地看出各独立变量之间的交互作用对响应值的影响。从标准残差图及模型预测值/实验值拟合曲线可直观地看出所建立模型与实验值的拟合情况。

图4A为微波功率和乙醇体积分数对山茱萸籽总黄酮提取率的影响，当液料比为20∶1mL/g、提取时间为10min时，图中乙醇体积分数对山茱萸籽总黄酮提取率的影响比较显著，其曲线呈上升趋势，且变化幅度较大，但在乙醇体积分数为50%处提取率开始缓慢下降。微波功率的曲线较平缓，表明其对提取率影响较小。从等高线图中可以看出微波功率与乙醇体积分数的交互作用对山茱萸籽总黄酮提取率的影响不显著。由图4A可确定最佳水平范围：微波功率320~ 400W，乙醇体积分数50%~60%。

图4B为乙醇体积分数50%、提取时间10min时液料比和微波功率对山茱萸籽总黄酮提取率的影响，从图中可以看出，液料比对山茱萸籽总黄酮提取率的影响比较显著，其曲线呈现先增大后减小的趋势。微波功率的曲线较平缓，表明其对提取率影响较小。由此可确定最佳的水平范围液料比为20~25mL/g，微波功率320~400W。

图4C为微波功率和提取时间对山茱萸籽总黄酮提取率的影响，提取时间、微波功率的二次项对山茱萸籽总黄酮提取率的影响十分显著。从等高线图中可以看出微波功率与提取时间的交互作用对山茱萸籽总黄酮提取率的影响极显著。从图中可确定最佳的水平范围为微波功率320~400W，提取时间10~ 15min。

图4D为乙醇体积分数和液料比对山茱萸籽总黄酮提取率的影响，乙醇体积分数、液料比的二次项对山茱萸籽总黄酮的提取率的影响十分显著。从图中可确定最佳的水平范围为乙醇体积分数50%~60%，液料比为20~25mL/g。

图4E为乙醇体积分数和提取时间对山茱萸籽总黄酮提取率的影响，从图中可确定最佳的水平范围为乙醇体积分数50%~60%，提取时间10~15min。

图4 山茱萸籽总黄酮提取条件的响应曲面及标准残差图Fig.4 Response surface plots and normal plot of residuals for optimizing the Cornus officinalis seed total flavonoids extraction condition

图4F为液料比和提取时间对山茱萸籽总黄酮提取率的影响，从图中可确定最佳的水平范围为液料比为20~25mL/g，提取时间10~15min。

图4G与4H分别为标准残差图与模型预测值/实验值拟合曲线图，从图4G可以看出，响应值与实验值拟合较好（0.05＜p＜F）。从图4H可以看出，实验值与预测值几乎在一条直线上，表明模型能够较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以利用该模型确定最佳提取工艺条件。

通过对模型方程求导计算，得到山茱萸籽总黄酮提取的最佳条件为：微波功率353.29W，乙醇体积分数50.53%，液料比19.76mL/g，提取时间13.05min。在此最佳条件下，山茱萸籽总黄酮的一次理论提取率为7.21%。考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为微波功率350W，乙醇体积分数50%，液料比20mL/g，提取时间13min，3次平行实验得到的实际平均得率为6.78%，其相对标准偏差小于2%。

3 结论

本文采用响应曲面优化法对微波辅助提取山茱萸籽总黄酮的工艺进行了优化，在所确定的工艺条件下山茱萸籽总黄酮的一次提取率达到6.68%，其含量介于山茱萸肉总黄酮含量的3.84%~8.61%[9-10]。说明山茱萸籽具有较好的药用、保健功能；此外，该方法萃取时间短、提取率高，表明响应曲面优化微波辅助提取工艺条件更科学、有效，该研究为山茱萸籽的开发利用提供了一定的参考。

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Optimization of microwave-assisted extraction of total flavonoids from Cornus officinalis seed by response surface methodology

LIU Rui-lin，ZHAN Han-ying，ZHANG Zhi-qi*
（Key Laboratory of Medicinal Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry of Ministry of Education，School of Chemistry and Chemical Engineering，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

Objective：A microwave-assisted extraction（MAE）method was studied for the extraction technology of total flavonoids from Cornus officinalis seed.Method：The total flavanoids contents of Cornus officinalis seed was determined by using ultraviolet-spectrophotometry method with rutin as reference substance.Using the content of total flavonoids in dry extract as a major evaluating factor，the best combination of extraction parameters was obtained with response surface methodology（RSM）.Results：The best extraction parameters were as follows：microwave power 350W；alcohol concentration 50%；solvent to sample ratio 20mL/g；extraction time 13min.Under these best conditions，the extraction yield of Cornus officinalis seed total flavonoids was 6.68%.Conclusion：The Cornus officinalis seed contain much higher total flavonoids content，and the technology had many advantages such as high yield，high speed，simple operation and so on.

microwave-assisted extraction；Cornus officinalis seed；total flavonoids；response surface methodology（RSM）

TS201.1

B

1002-0306（2012）07-0228-04

山茱萸（Cornus officinalis Sieb.et Zucc.）为山茱萸科落叶灌木或小乔木，是一种常用的名贵中草药。山茱萸性味酸、涩、微温，归肝肾经，具补益肝肾、涩精固脱之功效[1]。目前，对山茱萸果肉的化学成分已有较多研究，发现山茱萸肉中含有环烯醚萜苷、有机酸、鞣质以及维生素、氨基酸和挥发油等多种药用及营养保健成分[2-4]；但对山茱萸籽的相关研究报道较少。黄酮类化合物具有止咳、平喘、祛痰、抗炎、调节免疫、抗衰老及保护心血管的作用[5-6]。目前，黄酮类化合物的提取方法主要有溶剂提取法、微波提取法、超声波提取法、酶解法、超临界流体萃取法、双水相萃取分离法和半仿生提取法等。微波辅助提取法具有选择性高、提取时间短、易挥发性成分的提取率高以及不需要特殊分离步骤等优点[7]，但尚未见到山茱萸籽总黄酮微波辅助提取的研究报道。本实验采用响应曲面优化法（RSM）对微波辅助提取山茱萸籽总黄酮的工艺条件进行了研究，同时以芦丁为对照品，采用紫外-分光光度法对山茱萸籽总黄酮的含量进行测定，旨在为开发利用山茱萸籽这一丰富的天然药物资源提供参考依据。

2011－06－29 *通讯联系人

刘瑞林（1987-），男，硕博连读研究生，主要从事天然药物化学有效成分研究。

国家自然科学基金资助项目（20875060）。