肺纤维化抗补体活性道地药材筛选研究

刘 哲，雷钧涛

（吉林医药学院，吉林省 吉林市 132013）

近年来肺纤维化发病率和致死率呈不断上升趋势，研究表明肺纤维化与机体免疫能力下降以及肺间质组织受到损害有直接关系[1]。另外，有报道称重症非典型性肺炎，即SARS也和补体系统的激活程度有关[2－3]。

补体系统作为人体重要的免疫防御系统之一，可以抵御外来微生物侵害，并且在维持机体平衡等生理过程方面起着重要作用[4]。目前临床广泛应用的抗补体活性药物大多为非天然产物类补体抑制剂，长期使用易产生各种副作用，且治疗费用昂贵以及在适应证选择等方面存在诸多问题。徐晗、章蕴毅等[5]报道称，近年来在天然产物中分离出的多种结构类型的抗补体活性成分中，以多聚糖化合物和糖基化蛋白为多，通过体外抗溶血实验能够筛选出生物活性较好的一些化合物。植物药中广泛存在具有抗补体作用的活性成分，多糖作为主要活性成分之一具有显著的抗补体活性。研究表明，在许多中草药中含有多糖成分，其中大多数为酸性杂多糖，而组成其酸性部分多为葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸[6]，它们对补体活性起到一定的调节作用，其作用机制是在补体蛋白上存在识别点，可以识别多糖的结构，从而激活补体系统[7]。因此，以植物药中多糖用作新型补体抑制剂的研究与开发，日益受到国内外学者的关注。

东北作为我国中药的重要产区之一，中草药资源丰富。许多中草药在经多年临床应用后，证明具有较好的抗过敏、消炎和免疫调节作用，这就为从中寻找有效抗补体活性成分提供了可能。本文选取桔梗、桑皮、杏仁等多种东北道地药材，通过采用体外溶血试验考察其总抗补体活性，为天然药物抗补体活性的进一步研究奠定基础。

1 实验材料

1.1 道地药材

本文选取苍术、桔梗、桑皮、杏仁、前胡、独活等16种东北道地药材，经吉林医药学院雷钧涛教授鉴定均为正品。药材粉碎过40目筛，备用。

1.2 试剂

α-萘酚、CaCl2、EGTA、MgCl2、NaCl、NaOH、95%乙醇、乙醚、苯酚、巴比妥钠、巴比妥、丙酮、硫酸、三氯醋酸、枸橼酸钠等均为分析纯。

1.3 仪器

R-3型旋转蒸发仪（步琪，瑞士）；TD-5A型低温高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）；Well scan MK3型酶标仪（Thermo Labsyst，芬兰）；TH2-0型恒温振荡器（北京浪华时代科技发展有限公司）；Freezedryerl8型冷冻干燥器（Labconco公司，美国）。

1.4 动物

豚鼠（200～250g），雌雄不限，吉林大学实验动物部提供。

2 实验方法

2.1 提取

实验采用乙醇渗漉提取。取每种药材10g，煮沸3次，煮沸后将母液合并、浓缩，用三氯醋酸在4℃下脱蛋白；离心后，取上清液用NaOH中和，流水透析48h；浓缩，经乙醇沉淀；沉淀冷冻干燥得粗多糖[8]。

2.2 补体经典途径的溶血活性（CH50）测定[9]

2.2.1 溶液配制

配制5倍浓缩巴比妥缓冲液（5×BBS），使用时稀释成巴比妥缓冲液（BBS）。2%羊红细胞（SRBC）：取绵羊血2mL，用BBS洗涤，后以800r·min－1离心3min，重复3次，再以3000r·min－1离心10min，然后用BBS配制成2%SRBC。1000溶血素：用BBS配制成1∶1000溶血素溶液。

供试溶液：分别称取上述各供试药材粗多糖4mg。用BBS超声溶解成1∶1溶液，浓度为5mg·mL－1；分别加BBS稀释，制成1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128共8个浓度的供试品溶液。

2.2.2 补体制备及效价测定

取豚鼠股动脉血10mL，4℃放置，凝固1h，以800r·min－1离心5min，取血清，加2mL 2%SRBC，混匀后，以800r·min－1离心5min，取上清作为补体分装，置-70℃冷冻保存备用。

补体经典溶血系统的建立：取补体0.1mL，加入BBS配制成1∶10溶液，再用BBS分别以1／2倍稀释，配制成1∶20、1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640和1∶1280溶液。分别取1∶1000溶血素、各浓度补体、2%SRBC各0.1mL，溶于0.3mL BBS中混匀，于37℃水浴中加热30min，4℃条件下以5000r·min－1离心10min。分别取上清0.2mL，在405nm测定吸光度。实验同时设置全溶血组（0.1mL 2%SRBC溶于0.5mL蒸馏水中），详见表1。以蒸馏水溶血管的吸光度作为全溶血标准，计算溶血率。以补体稀释倍数为X轴，溶血百分率为Y轴作图。选择达到高溶血率的最低补体浓度作为确保体系能正常溶血所需的临界补体浓度。

表1 补体经典途经溶血实验中所加各成分的体积（mL）

2.2.3 药物经典途径抗补体活性测定

取确定临界浓度的补体与供试品混匀，按照表1加入适量BBS、溶血素和2%SRBC，于37℃水浴加热30min，4℃条件以5000r·min－1离心10min，分别取上清0.2mL，用酶标仪在405nm下测定吸光度。实验同时设置多糖对照组、补体组和全溶血组。以供试品浓度作为X轴，溶血抑制率作为Y轴作图。

3 结果

3.1 经典途经筛选结果

将5个不同批次稀释补体加入溶血体系中，评价其效价。在补体稀释浓度为1∶10～1∶40时，溶血率接近100%，体系基本达到全溶血。因此以稀释比例为1∶40的豚鼠血清作为以下经典途径筛选实验中所使用的补体，见图1。

图1 经典途经不同稀释度的豚鼠血清的效价（%，n＝5）

3.2 供试药物经典途径抗补体活性测定结果

根据“2.2.3”项下，对16种药材的抗补体活性进行测定，结果表明供试药材中苍术的最大溶血抑制率最高，为98.2%，超过相应浓度肝素的最大溶血抑制率，表明抗补体活性良好。苦杏仁等其它供试药材的最大溶血抑制率明显偏低，表明体外抗补体活性不佳。结果见图2、图3。

图2 供试药物抗补体活性

图3 供试药物抗补体活性

4 讨论

目前临床应用非天然产物类补体抑制剂治疗各种肺纤维化，虽然对该病起到一定的治疗作用，但长期应用会降低机体的防御机能，可产生多种副作用和并发症。传统中药中大多数活性成分可以直接被机体消化吸收，说明从天然产物中开发出高效、低毒的补体抑制剂是可能的。此外，从天然产物中开发的补体抑制剂还具有成本低的优点。

本文通过对东北16种道地药材进行体外溶血试验，旨在筛选出具有一定抗补体活性的天然药物。结果显示在供试药材中药物浓度在0.08mg／mL时，苍术的溶血抑制率最大，活性较好，为进一步研究天然药物在治疗肺纤维化、开发高效低毒天然补体抑制剂奠定基础。

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