伏毛铁棒锤药材HPLC指纹图谱研究

马学琴，康小兰，王 飞，付雪艳，何志梅

（宁夏医科大学 药学院，宁夏 银川 750004）

铁棒锤是毛茛科乌头属植物铁棒锤Aconitum szechenyianumGay.和伏毛铁棒锤Aconitum Flavum Hand.Mazz.的干燥块根[1]。2010年版中国药典未收载品种，为陕、甘、宁等省应用较广的一种民间草药[2]。其味苦辛，性热，有大毒，具“活血祛瘀，祛风湿，止痛”等作用[3]。目前，课题组对其所含的总生物碱以及乌头碱的含量已有研究[4－5]。本研究继续从综合评价伏毛铁棒锤质量的角度出发，建立其HPLC指纹图谱，为伏毛铁棒锤药材的鉴定提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

日立LC-2000高效液相色谱仪；岛津UV-2550紫外分光光度计；奥豪斯AP210型分析天平。

1.2 药品与试剂

乌头碱对照品（批号110720-200409）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国TEDIA）；娃哈哈纯净水；其它试剂均为分析纯。铁棒锤为自采，来源：固原六盘山（样品编号S1－S3）、月亮山（样品编号S4－S5）、种植园（样品编号S6－S8）、黑城乡（样品编号S9－S10）；经宁夏医科大学药学院生药学教研室鉴定为毛茛科乌头属植物伏毛铁棒锤AconitumFlavum Hand.Mazz.的干燥块根。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：美国 Thermo ODS-2HYPERSIL（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A-甲醇－乙腈（3∶2），B-醋酸－醋酸钠（pH＝4.5）缓冲液梯度洗脱：0～10min 1%～5%A，10～30min 5%～15%A，30～40min 15%～25%A，40～50min 25%～80%A，50～60min 80%～100%A，60～70min 100%A；检测波长：240～280nm，流速0.8mL／min，柱温：30℃。

2.2 对照品溶液制备

精密称量乌头碱对照品5.6mg，置5mL容量瓶中，色谱甲醇溶解，定容，得乌头碱对照品贮备液。

2.3 供试品溶液制备

取伏毛铁棒锤药材，粉碎，过80目筛，60℃干燥至恒重。精密称取适量（相当生药1g），置200mL具塞三角锥形瓶中，加入氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）20mL，超声提取40min，冷却，过滤，滤液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至10mL得供试品溶液，临用前0.45μm微孔滤膜过滤。

2.4 伏毛铁棒锤药材指纹图谱方法学考察

（1）精密度试验：按“2.3”项下方法制备供试品溶液，取同一供试液，连续进样6次，按“2.1”色谱条件测定，选择25个共有峰进行比较。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD＜0.23%，各共有峰的相对峰面积RSD＜2.14，表明供试品的精密度良好。

（2）重复性试验：取同一批次伏毛铁棒锤药材，按“2.3”项下方法平行操作，制备6份供试液，按“2.1”色谱条件测定。结果表明，各共有峰的相对保留时间RSD＜1.15%，各共有峰的相对峰面积RSD＜2.78，表明方法的重现性良好。

（3）稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样测定，对25个共有峰进行比较，结果各共有峰的相对保留时间RSD＜0.21%，各共有峰的相对峰面积RSD＜1.66%，表明供试品溶液在24内稳定。

3 结果

3.1 指纹图谱的采集及共有峰的标定

按照“2.3”项下方法，制备10批次伏毛铁棒锤供试液，按“2.1”色谱条件测定并记录色谱图。采用国家药典委员会颁布的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件自动匹配10批次伏毛铁棒锤药材HPLC色谱图相关参数，以平均数法作为对照指纹图谱的生成方法，设时间窗宽度为0.2min，提取伏毛铁棒锤药材的共有模式建立对照指纹图谱，见图1。

图1 伏毛铁棒锤药材对照指纹图谱

标定共有峰共25个，以峰面积较大的5号峰为参照物峰，分别计算其余共有峰与5号参照物峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，10批次伏毛铁棒锤药材共有峰的相对保留时间RSD小于0.5%，而相对峰面积RSD在11.34～27.61之间，说明各批次药材之间共有峰的保留时间有着很好的一致性，但由于来源的不同，其峰面积相差较大。

3.2 相似度计算

将10批伏毛铁棒锤药材样品指纹图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》软件，计算各样品指纹图谱与生成的对照图谱的相似度，样品S1～S10的相似度依次为0.927、0.901、0.953、0.918、0.911、0.926、0.916、0.933、0.937、0.903。结果表明，10批次药材与对照指纹图谱的相似度结果均大于0.9，相关性良好。

4 讨论

4.1 伏毛铁棒锤药材相似度评价

本实验所采集药材均来自宁夏中部干旱带固原地区，海拔高度在2600m左右，是伏毛铁棒锤聚集生长的地区。由于此地区土壤、水分、气候、阳光、温度等条件较为相似，并且所采集的伏毛铁棒锤均为两年生，故药材之间一致性较好，相似度均在0.9以上。

4.2 指纹图谱参照物峰的选择

本实验最初以乌头碱色谱峰作为参照物峰，但其峰面积相对较小（峰面积＜总峰面积的5%），根据《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》中的规定，峰面积相对较小的色谱峰误差较大，不适宜作为参照物峰。故本实验选择峰面积相对较大的5号色谱峰作为参照物峰，其余共有峰与其的比值误差较小，结果较为准确。

4.3 波长的选择

本实验采用DAD检测器，在进行供试品溶液全波长扫描时，供试液的最大吸光度在260nm，故选用240～280nm整合波长的色谱图，能够捕捉到更多的色谱峰。

4.4 供试品制备方法的优化

本实验选用70%乙醇、100%甲醇、氯仿－甲醇（2∶1）、氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）等溶剂，回流、超声等提取方法，并进行了提取工艺的正交试验，以峰之间的分离度和峰的个数为指标，优选出氯仿－甲醇－水（6∶4∶1）为溶剂，超声提取时，供试液色谱峰的个数最多且分离度较好，故选用此法。

本研究建立了伏毛铁棒锤HPLC指纹图谱，从药材整体色谱图入手，选取了25个特征峰构成了伏毛铁棒锤的指纹图谱，能提供更全面的质量控制信息，为鉴别该药材提供了更多的参考数据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，1985.

[2]张银霞，张银娟，唐建宁，等.六盘山区伏毛铁棒锤资源调查的研究与评价[J].农业科学研究，2008，29（1）：55-57.

[3]王毓杰，张 静，田会萍，等.民族药铁棒锤炮制减毒原理初步研究[J].中国中药杂志，2010，35（5）：588-592.

[4]付雪艳，董 琳，权洪峰，等.铁棒锤总生物碱的含量测定[J].科协论坛，2007（8）：476.

[5]付雪艳，董 琳，张义伟，等.HPLC测定铁棒锤中乌头碱的含量[J].科协论坛，2007（8）：456.