KISS-I／MMP-9对子宫内膜异位症的表达及意义研究

傅向红，夏建妹，吴瑞瑾

（1.衢州市人民医院，浙江 衢州 324002；2.杭州市第一人民医院，浙江 杭州 310006；3.浙江大学附属妇产科医院，浙江 杭州 310016）

子宫内膜异位症（Endometriosis，EMs）是一种育龄妇女常见且难治的良性疾病，发病率较高，且有逐年上升趋势，所引起的痛经、下腹痛及不孕症，对育龄妇女的身体健康与生活质量造成了极大影响。但至今本病的发病机制尚不明确，因此临床难以找到彻底根治的疗法，但其具有浸润性生长、广泛种植转移和易复发的与恶性肿瘤相似的生物学行为，使一些与肿瘤细胞迁徙相关的基因和蛋白在EMs的发病中的作用成为目前研究的热点。

肿瘤抑制基因-I（KISS-I）是新近发现的肿瘤抑制基因，可有效抑制κβ（NF-κβ）表达，KISS-I表达下降时，抑制 NF-κβ的作用将会减弱，加强MMP-9的表达，导致细胞外基质溶解，从而有助于肿瘤细胞的侵袭、种植，但其在EMs的研究报道国内外较少，尤其是KISS-I的弱表达是否与月经周期有关，以及异位内膜的侵袭是否与月经周期有关等问题却少有报道。因此本研究免疫组化方法通过检测KISS-I及MMP-9在子宫内膜异位症患者增生期与分泌期子宫内膜中的表达及对比研究，探讨其临床意义及两者相关性，进一步明确EMs的发病机制，从而从病因上找到治疗EMs的方法。

1 资料与方法

1.1 资料来源及主要试剂

选择2009年10月－2011年10月在本院行腹腔镜或开腹手术的Ⅲ－Ⅳ期子宫内膜异位症（按修正的美国生育协会标准（rAFS）分期）患者48例（分泌期20例，增生期28例），年龄27～48岁，平均年龄（43.65±4.21）岁；取卵巢异位囊肿囊壁出现异位内膜组织患者为异位子宫内膜组（ECE）。选取其中30例（分泌期10例，增生期20例）子宫内膜患者为在位子宫内膜组（EUE），年龄32～48岁，平均年龄（45±3）岁。选择同期腹腔镜或开腹子宫切除手术患者27例（分泌期10例，增生期17例），术后经病理证实为正常子宫内膜患者，取其子宫内膜作为非子宫内膜异位症（EMs）患者组（CE组），年龄区间30～48岁，平均（46.35±3.68）岁。排除子宫内膜息肉，合并生殖器、子宫腺肌症及其它系统的恶性肿瘤，同时6个内未使用激素类药物；无心脏病史、糖尿病、高血压等疾病，所有肝、肾功能及血、尿常规均正常。鼠抗人 MMP-9单克隆抗体，兔抗人KISS-I单克隆抗体英国Abcam公司产品；柠檬酸盐缓冲液，PBS缓冲液，DAB显色试剂盒，中性树脂封片剂。

1.2 方法

分泌期、增殖期子宫内膜组织的分组，月经周期中，卵巢分泌的雌、孕激素作用于子宫内膜，使其功能层具有周期性增殖、分泌和脱落性变化，基底层在月经后再生并修复子宫内膜创面，重新形成子宫内膜功能层。据其组织学变化将月经分为增殖期、分泌期、月经期3个阶段（以1个正常月经周期28天为例），增殖期为月经第5～14日，组织学上表现为，内膜表面上皮、腺体、间质、血管均呈增殖性变化；分泌期为月经第25～28日，组织学上内膜较厚，腺体更增长、弯曲，出现分泌现象，血管迅速增加，更加弯曲，间质疏松水肿；月经期为月经周期第1～4日，为子宫内膜海绵状功能层从基底层崩解脱落期。按照患者月经不同周期进行手术，采集内膜组织，并经病理组织学证实为分泌期和增殖期内膜组织。

免疫组化方法检测子宫内膜组织中的KISS-I及MMP-9的表达定位：采用Envision二步法，按试剂盒说明书进行具体操作。以组织切片上出现黄色为阳性反应，免疫染色后的切片通过莱卡显微切割系统读片同时获取图像，使用图像分析软件（Image-proplus6.0）对图像进行半定量分析，测量黄色染色部分的光密度（IOD），并计算平均光密度值（MOD）。用显微切割系统在每张切片上组织染色区获取5个不同部位的视野图片，将免疫组化图片输入图像分析软件，分别测量各组子宫内膜组织中阳性部位的MOD，以空白对照，以缓冲液（PBS）取代第一抗体，其它各步不变的试剂对照染色，结果应为阴性对照值，其值为0.15。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 KISS-I在子宫内膜异位症患者子宫内膜组织的定位表达

KISS-I在ECE组、EUE组、CE组都有不同程度的表达，主要表达在内膜组织腺体、腺上皮细胞质和细胞膜上，如图1所示。

图1 免疫组化法定位EMs内膜组织中KISS-I的表达（免疫组化Envision二步法，放大400倍）

2.2 MMP-9在子宫内膜异位症患者内膜组织的定位表达

MMP-9在EMs患者的异位子宫内膜和在位子宫内膜以及非EMs患者的子宫内膜均有表达，MMP-9主要内膜组织腺体及腺上皮细胞质和细胞膜表达，内膜间质细胞有散在的表达如纤维细胞和血管上皮细胞，见图2所示。

图2 免疫组化法定位EMs内膜组织中MPP-9的表达（免疫组化Envision法，400x）

2.3 KISS-I、MMP-9蛋白在各组子宫内膜表达的免疫组织化学染色半定量分析

KISS-I和MMP-9在各组内膜腺体中阳性部位的表达的平均光密度值（MOD），其阴性对照表达的平均光密度为0.15，KISS-I和 MMP-9分别在各组内膜腺体中阳性表达率，见表1。无论增生期、分泌期，子宫内膜异位症患者的EUE组和CE组KISS-I表达均显著高于子宫内膜异位症患者的ECE组（P＜0.01），CE组KISS-I表达高于子宫内膜异位症患者的EUE组（P＜0.05），见表2。

表1 KISS-I及MMP-9在各组子宫内膜腺体中的阳性表达率

表2 KISS-I及 MMP-9在ECE组、EUE组、CE组平均光密度值表达 （MOD，）

表2 KISS-I及 MMP-9在ECE组、EUE组、CE组平均光密度值表达 （MOD，）

注：＊P＜0.05vs CE组；＊＊P＜0.01vs ECE组。

组别n KISS-I（MOD）MMP-9（MOD）ECE组48 0.15±0.11 0.61±0.13 EUE组 30 0.32±0.10＊，＊＊ 0.30±0.11＊，＊＊CE组 27 0.63±0.13＊＊ 0.15±0.09＊＊

2.4 KISS-I、MMP-9在各组不同月经周期子宫内膜表达的免疫组织化学染色半定量分析

ECE组、EUE组、CE组三组中 KISS-I、MMP-9的表达差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

表3 KISS-I、MPP-9在各组子宫内膜腺体中阳性部位的平均光密度值表达（MOD，）

表3 KISS-I、MPP-9在各组子宫内膜腺体中阳性部位的平均光密度值表达（MOD，）

注：＊P＜0.05vsCE组；＊＊P＜0.01vsECE组。

组别 n KISS-I（MOD±s）增生期 分泌期 n MMP-9（MOD±s）增生期 分泌期ECE组 24 0.15±0.14 0.16±0.09 24 0.61±0.13 0.60±0.14 EUE组 15 0.31±0.12＊，＊＊ 0.33±0.07＊，＊＊ 15 0.29±0.12＊，＊＊ 0.33±0.11＊，＊＊CE组 14 0.61±0.14＊＊ 0.63±0.11＊＊ 13 0.14±0.06＊＊ 0.17±0.13＊＊

3 讨论

至今为止EMs发病机制尚不明确，目前关于异位子宫内膜的来源有众多学说如Sampson种植学说、体腔上皮化生学说以及诱导学说等，在众多学说中Sampson的经血逆流种植学说一直占据主导地位。该学说认为，在EMs病理发展过程中，子宫内膜细胞的迁徙发挥着始动和基础的作用，原因就在于经血逆流为EMs的发病机制提供了条件，细胞迁徙是EMs发生的关键。细胞迁徙的过程包括：内膜细胞与细胞外基质（ECM）黏附、基质降解、内膜细胞的移行以及最终在卵巢、腹膜等覆盖宫腔内膜以外组织种植、生长。

KISS-I基因是由Lee等[1]发现的一个新的能够抑制肿瘤转移基因。当KISS-I表达下降时，抑制NF-κβ作用就会减弱，NF-κβ表达就会提高，从而导致 MMP-9表达加强。MMP-9是MMPs组系列中的一员，能够有效降解细胞外基质成分。Yan等[2]研究报道，在 MMPs、mRNA呈阳性并且缺乏KiSS-1mRNA6细胞株中，发现HT-1080细胞系经KISS-I转染后其MMP-9的量及活性明显下降，细胞的体外侵袭性亦降低。付慧仙等[3]研究显示，卵巢子宫内膜异位症患者的异位子宫内膜中MMP-9的表达强度明显高于正常子宫内膜；MMP-9在卵巢子宫内膜异位症患者在位内膜中的表达与在正常对照组子宫内膜中的表达无明显差异。刘学军等[4]研究结果表明，异位子宫内膜 MMP-9mRNA呈过表达状态且其表达强度随着疾病严重程度的加重而升高，从而进一步说明MMP-9的高表达更利于细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的降解，从而形成新生血管，利于异位内膜细胞异地侵袭、生长。本实验经过免疫组化定位及半定量分析证实了MMP-9在异位内膜的高表达，且ECE组、EUE组、CE组三组表达有明显差异性，表现为EUE组和EUE组表达均显著高于CE组，子宫内膜异位症患者的ECE组表达显著高于EUE组。

牛慧彦等[5]将生育年龄妇女的分泌晚期子宫内膜组织种植入裸鼠的盆腹腔，建立裸鼠EMs模型，采用RT-PCR方法，检测不同生长阶段异位内膜中 KISS-I mRNA及MMP-9mRNA的表达相对强度，结果发现EMs组KISS-I表达降低，而 MMP-9表达增强，差异显著，故认为KISS-I表达减弱和MMP-9表达增强可能与EMs的侵袭过程有关。本研究实验通过免疫组化半定量分析得出，非EMs患者子宫内膜、EMs患者的在位内膜及与之相匹配的异位内膜KISS-I表达逐渐减弱，而MMP-9表达增强，并且其在各组的表达有显著性差异，因此推测KISS-I、MMP-9可能参与EMs内膜细胞的侵袭、种植。

West等[6]通过定位研究发现KISS-I基因位于染色体1q32～q41位置间，由4个外显子构成，与多种肿瘤的转移侵袭有非常密切的关系。残基肽（Kisspeptins）作为KISS－I的衍生肽，Irwig等[7]发现KISS-I有可能是通过作用下丘脑弓状核部位的GnRH神经元，然后通过GPR54而产生效应并促进LH和FSH分泌，GnRH神经元是Kisspeptin调节的直接靶器官，KISS-I mRNA被性腺激素调节，提示KISSI在促性腺激素分泌的负反馈调节中起重要作用。Gottsch等[8]在研究中发现预先给予GnRH拮抗剂可阻断kisspeptin的促黄体激素（LH）、促卵泡激素（FSH）释放效应。Roa等[9]研究kisspeptin在不同生育期雌鼠中的表达，说明KISS-I在女性下丘脑－垂体－卵巢轴的内分泌调节中发挥重要作用，而EMs是激素依赖性疾病，与正常子宫内膜一样受卵巢激素的影响，但正常子宫内膜受卵巢激素的调节形成无疤痕的修复，但异位内膜且在异位组织形成过度纤维化，形成EMs，申庆文等[10]研究也证实，KISS-I在 EMs的表达降低，而EMs的侵袭转移可能会使MMP-9的表达增高。本研究结果显示KISS-I、MMP-9在三组内膜之间的表达有差异，但与月经周期的表达且无相关性，提示KISS-I基因不是影响MMP-9基因表达的唯一因素。

综上所述，本实验的数据证实KISS-I、MMP-9在子宫内膜异位症患者的异位内膜的差异性表达，表明KISS-I、MMP-9可能通过参与内膜细胞异位种植、侵袭而诱发了子宫内膜异位症，这为我们探讨子宫内膜异位症的发病机制以及寻找治疗子宫内膜异位症途径提供了一条思路。

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