高效液相色谱法测定桂枝茯苓丸制剂及含药血清中芍药苷、肉桂酸、丹皮酚
2012-11-02魏新智王清华付勇强孙科峰
樊 晖，田 原，魏新智，王清华，付勇强，孙科峰
（辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）
桂枝茯苓丸出自汉·张仲景《金匮要略》，由桂枝、茯苓、牡丹皮、芍药、桃仁五味药组成，主治妇人癥病下血。该方自宋以来被拓展用于治疗妇科经、带、胎、产、杂等血瘀诸症，近十年来用于治疗癥病（子宫肌瘤）等性激素依赖性疾病取得了较好的效果。因其疗效确切，故为历代方书所收载，《国家药典》亦基本按原方的药味组成、剂量配比、制法用量、主治功效进行收录。为了对桂枝茯苓丸的配伍原理、有效成分及作用机制进行进一步研究，本实验对桂枝茯苓丸制剂及含药血清中的指标性成分进行了检测，以建立高效液相检测方法。
1 仪器与材料
1.1 仪器
DZF－250小型真空干燥箱（郑州长城科工贸有限公司）；HS3120型超声波清洗器；TD10001电子天平：浙江余姚金诺天平仪器有限公司。TG328B分析天平：上海天平仪器厂。低温高速离心机：Heraeus Biofuge，28RS，德国生产。SANYO超低温冰柜：MDF－382E，日本生产。美国Agilent1100高效液相色谱仪，G1311A四元梯度泵，G1313A自动进样器，G1315柱恒温箱，G1315B二极管阵列检测器 。
1.2 药品与试剂
高效液相用甲醇、乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水，其它试剂为分析纯，对照品丹皮酚（0708－9704）、肉桂酸（0786－9802）、芍药苷（110736－200422），由中国药品生物制品检定所提供。桂枝、茯苓、牡丹皮、芍药、桃仁药材购于辽宁中医药大学附属医院中药房，用粉碎机粉碎，过120目筛，备用。
1.3 动物
Wistar大鼠，雌性，体重180～220g，由沈阳医学院实验动物中心购进，合格证号：SCXK（辽）2003－0016。颗粒饲料，由沈阳市于洪区前民动物饲料厂提供，合格证号：（辽）检字001号。所有动物实验前于辽宁中医药大学附属医院SPF中心观察1周后使用，合格证号：SYXK（辽）2004－0032。温度22～23℃，湿度30%～50%。
2 方法与结果
2.1 供试品配制
桂枝茯苓丸的配制。高剂量：按等比例称取桂枝、茯苓、牡丹皮、芍药、桃仁药材粉末32.5g加蒸馏水至100mL混匀，备用。低剂量：按等比例称取桂枝、茯苓、牡丹皮、芍药、桃仁药材粉末16.25g加蒸馏水至100mL混匀，备用。
2.2 桂枝茯苓全丸制剂中芍药苷、肉桂酸、丹皮酚测定
2.3.1 芍药苷测定
测定方法：照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》2010版一部附录VI D）测定。色谱条件：Agilent XDB-C18色谱柱，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（15∶85），检测波长：230nm，流速1mL／min，柱温25℃。
对照品溶液制备：取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.3mg溶液。
供试品溶液制备：取自制桂枝茯苓丸供试品适量，蒸干，取干膏精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，浸泡4h，超声处理20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
结果：供试品在相同条件下检出了芍药苷，阴性液无干扰（见图1、图2）。
图1 芍药苷对照品HPLC色谱
图2 桂枝茯苓丸供试品HPLC色谱
2.2.2 丹皮酚测定
测定方法：同芍药苷。色谱条件：Agilent XDB-C18色谱柱流动相：甲醇－水（45：55），检测波长：274nm，流速1mL／min，柱温25℃。
对照品溶液制备：取丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.3mg溶液。
供试品溶液制备：同芍药苷。
结果：供试品在相同条件下检出了丹皮酚，阴性液无干扰（见图3、图4）。
图3 丹皮酚对照品HPLC色谱
图4 桂枝茯苓丸供试品HPLC色谱
2.2.3 肉桂酸测定
测定方法：同芍药苷。色谱条件：Agilent XDB-C18色谱柱乙腈-0.1%磷酸水溶液（25：75），检测波长：285nm，流速1mL／min，柱温25℃。
对照品：取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.2mg溶液。
供试品：取自制桂枝茯苓丸供试品适量，蒸干，取干膏精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，浸泡4h，超声处理20min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
结果：供试品在相同条件下检出了丹皮酚，阴性液无干扰（见图5、图6）。
图5 肉桂酸对照品HPLC色谱
图6 桂枝茯苓丸供试品HPLC色谱
2.3 桂枝茯苓丸含药血清中芍药苷、肉桂酸、丹皮酚测定
2.3.1 含药血清的制备
取雌性大鼠随机分为空白组、全方高、低剂量组，每组10只。除空白组外，其余各组每天按规定的剂量口服给药，给药体积为1mL／100g，空白组每日灌胃口服给予等体积生理盐水，连续给药7d。实验进行到第8天大鼠（禁食16h）给药后1h，从大鼠腹主动脉取血，以3000r／min，6℃冷冻，离心20min，取血清，备用。
2.3.2 丹皮酚测定
测定方法：照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》2010版一部附录VI D）测定。
色谱条件：色谱柱：Diamonsil-C18柱，4.6mm×250mm，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（35∶65），流速1mL／min，柱温25℃，检测波长：274nm。
对照品溶液制备：取丹皮酚对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.3mg溶液。
供试品血清处理方法：取含药血清0.1mL加0.2mL乙腈，涡旋混合1min，4000rpm离心5min，取上清液，过滤，备用。
测定法：精密吸取对照品溶液5μL与供试品溶液30μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
结果：含药血清在相同条件下检出了丹皮酚，阴性液无干扰（见图7、图8）。
图7 丹皮酚对照品HPLC色谱
图8 桂枝茯苓丸含药血清HPLC色谱
2.3.3 肉桂酸测定
测定方法：照高效液相色谱法（《中华人民共和国药典》2010版一部附录VI D）测定。
色谱条件：色谱柱：Diamonsil-C18柱，4.6mm×250mm，流动相：乙腈-0.1%磷酸水溶液（35∶65），流速1mL／min，柱温25℃，检测波长：285nm。
血清处理方法：取含药血清0.1mL加0.2mL乙腈，涡旋混合1min，4000rpm离心5min，取上清液，过滤，备用。
测定法：精密吸取对照品溶液5μL与供试品溶液30μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
对照品溶液制备：取肉桂酸对照品适量，加甲醇制成每毫升含0.2mg溶液。
结果：供试品在相同条件下检出了肉桂酸，阴性液无干扰（见图9、图10）。
图9 肉桂酸对照品HPLC色谱
图10 含肉桂酸血清HPLC色谱
2.3.4 芍药苷测定
对含药血清分别采用了乙酸乙酯萃取法、乙醚萃取法及甲醇沉蛋白方法，也尝试了多种色谱条件，均未检出芍药苷。
3 结语
HPLC法是目前最常用的定性定量方法，结果可靠，重复性好，成本低廉。本实验采用HPLC法检测了桂枝茯苓丸中的指标性成分芍药苷、丹皮酚、肉桂酸，并且对桂枝茯苓丸含药血清中的三种成分进行了检测，建立了检测方法，为阐明桂枝茯苓丸组方的配伍原理、进一步深入研究桂枝茯苓丸的体内作用机制奠定基础。
桂枝茯苓丸含药血清中未检出芍药苷成分，可能是由于芍药苷在体内代谢时间比较短，采血时浓度较低，HPLC的DAD检测器未能检出等多方面原因。
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[M].北京：中国医药科技出版社，2010.
[2]李辉，任平，黄熙，等.高效液相色谱法同时测定健康人口服加味逍遥散后血清阿魏酸和芍药苷含量及其药动学研究[J].中西医结合学报，2008（11）.
[3]孙言才 沈玉先 孙国平 屈建 陈礼明 魏伟反相高效液相色谱法检测小鼠血清中丹皮酚浓度[J].中国医院药学杂志，2004（1）.
