HPLC双波长融合法测定忍冬藤药材中三种有效成分的含量

2012-11-02包永睿孟宪生

亚太传统医药 2012年12期

姚宣，包永睿，孟宪生，王帅

（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连 116600）

忍冬藤为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，性甘、寒，归肺、胃经。收载于2010版中国药典一部，具有清热解毒、疏风通络功能。现代化学、药理研究表明：忍冬藤中的主要活性成分为有机酸类和环烯醚萜苷类，绿原酸和咖啡酸具有一定的抗菌抗感染作用，在忍冬藤中含量较高，为其主要活性成分，马钱苷有抗炎作用及调节免疫功能作用，三者共同发挥药效清热解毒、疏风通络，测定这三个成分的含量能够更好地整体评价药材的内在质量。

本文以高效液相色谱法结合多波长融合技术，根据三种成分不同的光谱特性，建立了在两个紫外检测波长下同时测定绿原酸、咖啡酸、马钱苷三个成分含量的方法，该方法通过一针多测，节省了时间，节约了溶剂，克服了单波长检测时信息量有限的缺点，以一张图谱全面、真实地揭示中药材的内在质量特征。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1100Series高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，自动进样，ChemStation工作站（Agilent科技有限公司）；Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5m）；CP225D 电子分析天平（德国Sartorius，十万分之一）；HS6150型超声波清洗器（天津恒奥科技发展有限公司）。

1.2 试药

绿原酸（中国药品生物制品检定所，批号110753－200413），咖啡酸（中国药品生物制品检定所，批号110885－200102），马钱苷（中国药品生物制品检定所，批号111640－200503）；忍冬藤（购自大连保健大药房）经辽宁中医药大学翟延君教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥茎枝，乙腈、甲醇、甲酸，实验用水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（4.6mm×250mm，5m）；流动相：A-3%甲酸水，B-乙腈（梯度洗脱程序：0～30min，9%B；31～35min，15%B；36～60min，18%B；61～70min，23%B）；流速：1.0mL／min；柱温：25℃；检测波长：236、327nm；进样量10μL。

2.2 对照品溶液的制备

绿原酸对照品溶液：精密称取绿原酸对照品适量，加50%甲醇制成0.391mg／mL对照品溶液，备用。咖啡酸对照品溶液：精密称取咖啡酸对照品适量，加50%甲醇制成0.147mg／mL对照品溶液，备用。马钱苷对照品溶液：精密称取马钱苷对照品适量，加50%甲醇制成0.217mg／mL对照品溶液，备用。

2.3 供试品溶液的制备

取忍冬藤粉碎（过3号筛）约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定重量，超声处理（250W，30kHz）30min，放冷，再称定重量，用50%甲醇补足减失的重量，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线与线性关系

取浓度为0.103mg／mL，0.049mg／mL，0.144mg／mL的绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品，精密吸取上述对照品溶液4、7、10、13、16、19μL，注入液相色谱仪，测得峰面积积分值。以对照品的含量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准工作曲线。结果表明，绿原酸的回归方程是Y＝21.751X－33.913（r＝0.9999，n＝6），在0.5212～2.4757μg／mL范围内线性关系良好；咖啡酸的回归方程是Y＝59.891X－27.598（r＝0.9999，n＝6），咖啡酸在0.1960～0.9310μg／mL范围内线性关系良好。马钱苷的回归方程是Y＝15.549X－8.5666（r＝0.9999，n＝6），马钱苷在0.5760～2.7360μg／mL浓度范围内线性关系良好。

2.4.2 精密度试验

分别精密吸取“2.2”项下配制的绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品10μL，连续进样6次，记录236、327nm波长下的色谱图，按照最大峰面积覆盖融合图谱，结果融合后图谱中绿原酸、咖啡酸、马钱苷各峰相对峰面积RSD分别为1.07%、0.95%、1.53%，均小于3.00%，表明检测系统的进样精密度良好。

2.4.3 重复性试验

按“2.3”供试品溶液的制备方法，取同一药材粉末，平行制备供试品溶液6份，按上述色谱条件进样10μL，记录236、327nm波长下的色谱图，按照最大峰面积覆盖融合图谱，结果以融合后图谱中各峰相对峰面积计算绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰含量，RSD 分别为 1.31%、1.26%、1.07%，RSD均小于3.00%，表明方法的重复性良好。

2.4.4 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液，分别在制备好样品供试液后的0、2、4、6、8、10h进样分析，按上述色谱条件进样分析，记录236、327nm波长下的色谱图，按照最大峰面积覆盖融合图谱，结果融合后图谱中绿原酸、咖啡酸、马钱苷各峰相对峰面积 RSD分别为1.34%、1.63%、1.16%，RSD均小于3.00%，表明样品在10h内稳定。

2.4.5 回收率试验

精密称取已知含量的忍冬藤药材粉末约0.5g，共6份，分别置具塞锥形瓶中，各精密加入适量绿原酸、咖啡酸、马钱苷对照品，再精密加入50%甲醇至25mL，超声处理30min，取出，放冷，按上述方法和条件提取测定。记录236、327nm波长下的色谱图，按照最大峰面积覆盖融合图谱，以融合后图谱中绿原酸、咖啡酸、马钱苷峰面积计算含量，计算加样回收率，绿原酸、咖啡酸、马钱苷平均加样回收率分别为99.60%、99.73%、99.48%，RSD小于4.00%。

2.5 样品测定

按“2.3”项下所述制备供试品溶液，按上述色谱条件进样，采用多波长融合技术，使用Matlab7.1编程对不同波长的色谱图进行融合，记录236、327nm波长下的色谱图，按照最大峰面积覆盖融合图谱。见图1、图2、图3。

3 讨论

中药化学成分复杂，常常通过多个成分共同发挥药效，单一成分定量难以完整地反映忍冬藤药材的化学组分特征，本文将现代分析检测手段结合多波长融合技术，对不同波长的中药材指标成分的谱图信息进行融合，互补不同类成分特征吸收的差异性，克服单一波长单一指标检测时信息量不足难以完整地反映药材质量的缺点，同时测定其中多项指标成分含量，获得每个成分的最大信噪比，增加了含量测定的准确度，在此中药的多个指标性成分基础上建立忍冬藤指纹图谱，科学合理、综合地评价药物质量，实现中药质量可控，保证疗效。

忍冬藤药材中主要含有有机酸类成分、环烯醚萜类成分，在327nm波长下，有机酸类成分绿原酸和咖啡酸有最大吸收，且环烯醚萜类成分马钱苷无吸收，236nm波长下，环烯醚萜类成分马钱苷有最大吸收，有机酸类成分绿原酸和咖啡酸吸收较小，经多波长融合，记录236nm、327nm波长下的色谱图，按照最大峰面积覆盖融合图谱，使用 Matlab 7.1将两个波长的结果融合，经多波长融合后，药材的多个指标性成分同时在一张图谱中具有最大吸收，从而同时测定药材中有效成分的含量，全面控制药材的质量。