RNAi研究肝癌侵袭转移相关基因进展

胡 卫，王 泉，方肇勤

（1.三峡大学 医学院，湖北 宜昌 443002；2上海中医药大学 基础医学院，上海 201203）

肝癌是我国最为常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌患者约占全球总患者数的55%，其相关死亡率排名第二，仅次于肺癌［1］。迄今为止针对肝癌的治疗缺乏行之有效的方法，应用最多的手术切除肝癌，其5年的复发转移率十分高，死亡率也居高不下［2］。肝癌的复发和转移有一系列基因参与调控，它涉及到细胞基因改变、侵袭力、黏附能力、产生局部血凝因子或血管生成的能力、分泌代谢功能以及肿瘤细胞与宿主、肿瘤细胞与间质之间相互关系的多步骤、多因素参与的过程［3］。RNA 干扰（RNAi）是由双链 RNA（double－stranded RNA，dsRNA）引起的广泛存在于动植物中的序列特异性转录后基因沉默，从而抑制其相应基因表达的过程。近年RNAi已被认为是真核生物基因表达的主要调节机制，由于其具有高效性、高特异性和高稳定性等特点，已成为基因功能研究的有力工具，广泛应用于阐述包括肿瘤在内的各种疾病的分子机制，为可能的基因治疗和药物治疗提供依据。近年来在肝癌研究中，通过RNA干扰技术抑制相关基因表达后，再检测细胞侵袭、迁移能力或者实验动物肿瘤的转移情况，揭示了肝癌发生发展、转移复发的分子机理。

1 肝癌转移复发的分子机制

肝癌转移复发涉及细胞粘附、运动、增殖、细胞外基质的降解、机体免疫与肿瘤血管生成等环节，其分子机制主要有：与侵袭相关的抑癌基因的失活和癌基因的表达增加、与转移和复发有关的细胞因子及其受体表达水平的变化、基质金属蛋白酶异常表达、肿瘤微血管密度的影响等。

2 肝癌转移复发相关基因的RNAi

现在已经发现了一大批与肝癌转移相关的基因，如H－ras基因、Bmi－1基因、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）基因、p53基因等。

2.1 H－ras基因

H－ras基因定位于11p15.5，由于它编码的蛋白质分子量为21kb，又被称为p21分子。在原发性肝癌中，H－ras癌基因mRNA及蛋白质水平均有明显升高。Wang等［4］应用磷酸钙转染法将H－ras基因导入人肝癌细胞株SMMC－7721，发现转染H－ras的细胞粘附能力提高、运动能力增强及cⅣase、EGFR表达增加，且上述变化与p21的表达显著相关，表明H－ras癌基因能在体外诱导人肝癌细胞的转移表型的产生，提高肝癌细胞的转移潜能。由于突变的H－ras基因与正常的H－ras基因碱基序列不同，利用RNAi的特异性可对突变的H－ras基因进行针对性抑制。有学者将H1启动子嵌入到MSCV病毒载体中组成siRNA载体，成功地抑制了ras基因的表达［5］。

2.2 CXCR4

趋化因子受体CXCR4（chemokine receptor4，CXCR4）是组织表达最为广泛的趋化因子受体之一，在肝癌中的高表达与其细胞的生长、侵袭、转移中都有很重要的作用［6］。夏斌等［7］将构建的靶向CXCR4的siRNA真核表达载体通过脂质体转染入人肝癌细胞SMMC7721后，发现干扰组能明显抑制肝癌细胞的生长和转移。

2.3 Rho－C基因

Rho－C（Ras homologous C）基因是 Rho家族的一个成员，参与细胞信号的传导、增殖和肌动蛋白细胞骨架的调节，在多种肿瘤尤其是转移侵袭性强的肿瘤中表达增高［8］。近年来发现Rho－C与肿瘤的侵袭、转移及转移表型的获得有密切关系［9］。有研究［10］用 Rho－C－siRNA 真核表达 载体转染SK2－Hep1肝癌细胞后，细胞中Rho－C蛋白表达水平降低达60%，细胞黏附、运动能力及体外侵袭能力均降低。ZHENG等［11］用Rho－C基因的RNA干扰载体转染肝癌细胞Bel7402，以沉默Rho－C基因表达，结果显示Rho－C基因沉默能够促进肝癌细胞Bel7402凋亡并抑制细胞迁移和非锚定生长能力。

2.4 OPN基因

骨桥蛋白（osteopontin，OPN）基因定位在人类基因组的4q13，它与肿瘤及原癌基因的调控密切相关。OPN含有与细胞粘附有关的精氨酸－谷氨酸－天冬氨酸（RGD）序列，并通过受体CD44、整合素等来促进细胞的趋化、粘附和迁移。Ye等［12］报道OPN在转移性、高侵袭性的肝癌中过表达。在试验中敲除掉OPN特异性抗体的细胞，无论在实验室还是植入裸鼠后，很快发生了转移。温敏杰等［13］的研究也证实了RNA干扰降低OPN的表达后，肝癌裸鼠移植瘤的体积和质量明显缩小。

2.5 HMGA1

HMGA1（High mobility group A1，高迁移率族蛋白A1）是位于细胞核内的小分子非组蛋白，参与细胞多种重要生物学过程。HMGA1在胚胎期表达丰富，而在成熟组织中则表达极少或缺失。在病理情况下，相当多的恶性肿瘤组织中均发现有HMGA1的高水平表达，并且其表达量与肿瘤恶性程度及转移能力成正相关［14，15］。朱明光等［16］成功建立了基因沉默HMGA1稳定细胞株；HMGA1基因沉默后，细胞增殖与质粒对照组和空白对照组相比显著降低，细胞凋亡百分率明显升高。

2.6 c－Met

原癌基因c－met编码的跨膜蛋白c－Met是肝细胞生长因子（HGF）的单一受体。大量的证据表明，HGF／c－Met信号通路异常在人类各种肿瘤转移中起重要作用，该通路的内源及外源抑制剂引起了人们的广泛关注。谢斌等［17］探讨了c－Met－siRNA对肝细胞癌生长和侵袭的影响，将构建好的c－Met－siRNA的逆转录病毒颗粒感染靶细胞 MHCC97－H后发现，目的基因的表达量显著降低，且细胞的生长、运动及侵袭均受到明显抑制。

2.7 CDC25B

CDC25B（cell division cycle 25B）是CDC25激酶家族的最重要成员，贯穿细胞周期的各阶段，其在细胞周期各期转换中起关键作用，在细胞有丝分裂过程中发挥重要作用。过量CDC25B可促进肿瘤生长和细胞恶性转化。Xin等［18］通过实时定量PCR和免疫组化染色方法证实CDC25B在肝癌组织表达明显高于正常肝脏组织，并将针对CDC25B基因的siRNA转染肝癌细胞株Hep3B和Hep40后，显著抑制CDC25B基因表达（90%），同时明显抑制了肿瘤细胞的增殖、运动和侵袭能力，将细胞阻滞在G2期，在接种Hep40的裸鼠身上也发现其能明显抑制肿瘤的生长。

2.8 Bmi－1

原癌基因 Bmi－1（B cell－specific moloney murine leukeria virus insertion site－1）是多梳基因家族（polycomb group genes，PcG）的成员之一，在细胞的增殖和干细胞自我更新、分化调节中发挥重要作用［19，20］。目前，已有多项研究报道Bmi－1在多种肿瘤如白血病、乳腺癌、肺癌、胃癌等中高表达，并且与肿瘤的转移和扩散相关［21］。李小磊等［22］将针对Bmi－1基因序列特异性的Bmi－1－siRNA转染高转移性人肝癌细胞株MHCC97－H，发现沉默Bmi－1基因表达可抑制肝癌细胞株MHCC97－H的侵袭迁移力。

2.9 P53

野生型P53是一种抑癌基因，与细胞的转化和肝细胞癌的发生关系密切［23］。在同时表达野生型P53和点突变P53的细胞中，RNA序列能特异地抑制突变型P53的表达，并在一定程度上恢复野生型基因P53的表达和功能［24］。有人［25］将外源性 P53dsRNA 瞬时转染肝癌 SK－Hep－l细胞系，发现P53dsRNA可明显抑制P53和部分抑制P21蛋白的表达，并明显促进SK－Hep－1细胞的增殖。

2.10 ICAM－1

血清可溶性细胞间粘附分子－1（Serum Intercellular Adhesion Molecule－1，sICAM－1）属于免疫球蛋白超家族成员，它不仅参与免疫效应细胞识别，而且在多种肿瘤细胞中过度表达，与肿瘤侵袭转移关系密切。廖维甲等［26］成功构建了针对该基因的pGenesil－1／ICAM－1表达载体并转染人肝癌细胞株Bel－7402和HepG2，并通过实时定量PCR和免疫组织化学方法检测肝癌细胞中ICAM－1基因表达抑制情况。结果表明经特异性siRNA作用后肝癌细胞中ICAM－1基因的表达受到抑制，同时细胞增殖受到抑制。

2.11 Hpa

Hpa（heparanase，肝素酶）是一种β－D－葡萄糖苷酸内切酶，在肿瘤细胞浸润、转移和肿瘤血管形成过程中起重要作用。檀英霞等［27］将脂质体介导的方法将构建的2个Hpa－shRNA真核表达载体稳定转染人肝癌细胞株HepG2（高表达Hpa），将干扰组和对照组的肿瘤细胞接种到裸鼠皮下，发现干扰后的HepG2细胞中Hpa mRNA和蛋白质表达明显降低，干扰组裸鼠的肿瘤生长速度明显变慢。

2.12 VEGF

VEGF（vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子）具有强大的刺激血管生成能力，可增加微血管的通透性，刺激内皮细胞分裂以及增加组织因子和一些蛋白酶的产生，在肝癌的发生、发展、转移中起促进作用。蒋冬贵等［28］将自主构建的pcDUVEGF－1和pcDUVEGF－2以及体外合成的 TWvegf－1和 TWvegf－2siRNA片段转染肝癌Hep－3B细胞，检测转染前后VEGF的 mRNA及蛋白表达水平，结果两种RNA干扰的方法均能显著抑制VEGF基因mRNA及蛋白质的表达。

2.13 ezrin

骨架蛋白的重排是引起细胞运动能力增加，肿瘤早期转移的基础。ezrin（膜－细胞骨架联接蛋白）作为ERM蛋白家族的成员，是一种胞膜与细胞骨架的联接蛋白。张岩等［29］先检测ezrin和骨架蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系中的表达，再选取高转移潜能SF7721和MHCC97－H细胞系为研究对象，发现RNA干扰可下调这两个细胞系中ezrin蛋白的表达，并且使其增殖和侵袭能力均显著下降。

3 展望

RNAi现象的发现及其分子生物学机制和功能的初步阐明，为成功地应用RNAi从基因水平研究肝癌提供了理论基础，为肝癌的靶向治疗奠定了基础。随着RNAi技术的迅速发展。有关肝癌发生、发展和转移的多基因、多位点研究取得了丰硕成果，充分显示了RNAi在肝癌研究中的巨大潜力和广阔的应用前景。RNAi研究肝癌转移复发相关功能，少见系统深入的研究报道，都是针对某个与肿瘤复发转移相关基因，构建载体研究其表达下调后对肝癌侵袭转移能力的影响，均没有进一步研究其作用机制。此外，目前对RNAi沉默目的基因后基因功能的检测，没有形成一套容易操作且能明确体现目的基因的主要生物学功能标准，这也是现阶段RNAi应用于肿瘤相关基因功能研究的一个重要问题；而且目前针对单基因的研究较多，而RNAi应用于系统研究多基因功能的报道较少见，而肝癌的发生是多因素、多基因共同作用的结果，开展多基因功能筛选、以细胞通路为研究对象是以后的发展趋势。

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