桂枝甘草汤对心阳虚心动过缓大鼠窦房结Gsα蛋白含量的影响

冯善涛，李立煌，任 利

（福建中医药大学 药学院，福建 福州 350108）

桂枝甘草汤出自张仲景《伤寒论》，是温心阳，养心气的祖方。方中以桂枝辛甘发散温通心阳，以炙甘草甘缓补虚温养心气［1，2］。原书用于治疗“发汗过多，其人叉手自冒汗，心下悸欲得按者”，现临床多用于治疗缓慢性心律失常，文献报道效果肯定［3-6］。本实验旨在通过复制心阳虚心动过缓大鼠模型，观察桂枝甘草汤对试验大鼠心率的影响，并通过检测试验大鼠Gsα蛋白含量，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 仪器

生理仪，BL-420，成都泰盟科技有限公司；BIOFUGE全能台式高速冷冻离心机；酶标仪，Bio-Tek ELX800光吸收；电泳仪、半干法转膜仪、化学发光成像仪，BIO-RAD。

1.2 药品与试剂

普萘洛尔片，陕西云鹏制药有限公司，批号B 080901；心宝丸，广东省药物研究所制药厂；桂枝、甘草，购自福建省药材公司，经鉴定桂枝为正品；生理盐水，福州海王福药制药有限公司，批号090822A04；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒、超敏ECL化学发光试剂盒、Tubulin抗体、山羊抗小鼠IgG均购自碧云天生物技术研究所；Gsα蛋白抗体，美国abcam 公司，编号ab83735；羊抗兔IgG，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号ZDR-5306。

1.3 实验动物

SPF级SD大鼠60只，体重（200±20）g，雌雄各半，购自上海斯莱克实验动物有限公司；普通饲料，福建中医药大学动物中心提供。

2 实验方法

2.1 实验动物分组

实验动物雌、雄分笼，适应性饲养1周后，分别随机分为空白组（K）、模型组（普萘洛尔90mg·kg-1）（M）、心宝对照组（剂量83mg·kg-1）（X）、和桂枝甘草汤高剂量组（2.4g·kg-1）（G）、中剂量组（1.2g·kg-1）（Z）、低剂量组（0.6g·kg-1）（D）。除空白组外，各组大鼠上午灌胃普萘洛尔（90mg·kg-1），下午分别灌胃生理盐水、心宝和各剂量的桂枝甘草汤，1次／d，连续7天。

2.2 一般体征检测

设定大鼠便状、扎堆、毛皮、神态、卷曲拱背、尾凉、体重、反应灵敏度8项体征评价指标，视各项指标对心阳虚诊断意义相同，每项指标，按轻重程度分为Ⅰ级1分、Ⅱ级2分、Ⅲ级3分。设每项指标7日总平均值为其终值，8项指标终值相加得累积分。设心阳虚程度为Y值，累积分为L值，Y＝L／8。给药期间，每日给药前专人观察评价各项指标并记录。

2.3 心率检测

于灌胃结束当日始，禁食24h，除桂枝甘草汤组及心宝组分别灌胃对应剂量药物，其它组灌胃生理盐水，2h后，10%水合氯醛3mL·kg-1腹腔注射麻醉，生理仪测各鼠心电图，持续5min，记录各鼠心率。

2.4 窦房结Gsα蛋白含量测定

于心脏界嵴部静脉窦侧、前腔静脉根部，取100mg的心肌组织块，参照细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒使用说明抽取膜蛋白，Bradford法定量蛋白浓度；参照凝胶配置试剂盒使用说明配制10%分离胶，5%浓缩胶；按照每4μL蛋白样品加入1μL蛋白上样缓冲液（5X）的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液（5X）。100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，直接上样到SDSPAGE胶加样孔内即可。以PBS和5X蛋白上样缓冲液调配蛋白样本浓度为10μg·μL-1，100℃加热10min，按照每4微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液（5X）的比例，混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液（5X）。100℃或沸水浴加热3～5min，以充分变性蛋白。冷却到室温后，直接上样到SDSPAGE胶加样孔内即可。冷却至室温后；每个样本平行上样两块胶（样本胶与复本胶），每块胶上样♀K、♀G、♀Z、♀D、♀M或♂K、♂G、♂Z、♂D、♂M，每孔上样10μL；80V、20min浓缩，100V、60min分离；样本胶与复本胶均15V、45min半干法转膜；封闭液（含5%脱脂奶粉，0.5%Tween-TBS）室温非特异性封闭2h；样本膜加Gsα蛋白抗体（按滴度1：100稀释）复本膜加Tubulin抗体（按滴度1：1000稀释），4℃过夜；0.5%Tween-TBS清洗2次，TBS清洗一次；分别加入羊抗兔IgG（按滴度1：10000稀释）、山羊抗小鼠IgG（按滴度1：1000稀释）室温孵2h；0.5%Tween-TBS清洗2次，TBS清洗1次；加ECL试剂，化学发光成像仪ChemiDoc XRS系统成像，Quantity One图像分析软件分析各蛋白条带灰度。

3 实验结果

3.1 桂枝甘草汤对实验大鼠一般体征的影响

表1 实验大鼠一般体征统计 （m±s）

如表1所示，模型组大鼠心阳虚程度明显高于空白组；桂枝甘草汤各剂量组大鼠心阳虚程度均明显低于模型组；中、高剂量桂枝甘草汤组大鼠心阳虚程度与空白组比较无明显差异。

3.2 桂枝甘草汤对实验大鼠心率的影响

如表2所示，模型组大鼠心率明显低于空白组；桂枝甘草汤各剂量组大鼠心率均明显高于模型组；中、高剂量桂枝甘草汤组大鼠心率与空白组、心宝组比较均无明显差异。

3.3 桂枝甘草汤对实验大鼠窦房结Gsα蛋白表达的影响

如表3所示，模型组大鼠窦房结Gsα蛋白含量明显低于空白组，各剂量桂枝甘草汤组大鼠窦房结Gsα蛋白含量均明显高于模型组，低剂量桂枝甘草汤组大鼠窦房结Gsα蛋白含量与空白组无明显差异性，中、高剂量桂枝甘草汤组大鼠窦房结Gsα蛋白含量明显高于空白组。

表2 实验大鼠心率 （次／min，m±s）

表3 实验大鼠窦房结Gsα蛋白含量 （%）

图1 实验大鼠窦房结Gsα蛋白

图2 实验大鼠窦房结复本胶内参Tubulin

4 讨论

窦房结Gsα蛋白含量的高低对起搏细胞离子通道蛋白活性及心率的调控具有重要的作用。Gsα蛋白，即刺激性鸟苷酸结合调节蛋白，是细胞内一类重要的信号传导蛋白。作为耦联与细胞表面受体和细胞内效应器的桥梁，是调节心脏功能的主要因素［7］。在窦房结神经血管内皮细胞受体-腺苷酸环化酶（AC）信号传导系统中，G蛋白以Gαβγ复合体的形式与受体和作为效应器的起搏细胞离子通道蛋白共同定位在细胞膜上。当交感神经兴奋时，肾上腺激素受体被激活，并与Gαβγ复合体相互作用，使Gsα亚基游离；游离的Gsα蛋白介导PKA（cAMP依赖蛋白激酶）激活，促进cAMP的合成，并通过cAMP介导HCN（环核苷酸门控）、Cav1、K等离子通道磷酸化，增加通道活性，增加If、ICa-L、IK等；进而引发动作各相电位变化、窦房结自律性和激动能力提高等一系列心率正性效应［8］。

实验结果显示，桂枝甘草汤能明显提高心动过缓大鼠的心率，对正常大鼠心率无明显影响，作为心脏功能调节主要因素的Gsα蛋白随桂枝甘草汤剂量增加持续增加，桂枝甘草汤对大鼠窦房结Gsα蛋白含量的调节是其治疗心动过缓的机制之一。

［1］王秋，王占石.桂枝甘草汤温经通脉的药效学研究［J］.中医药研究，2002，18（5）：41-42.

［2］吕英，高洁.桂枝甘草汤“辛甘化阳”配伍的实验研究［J］.中药材，2010，33（8）：1297-1299.

［3］洪丽生，刘长节.桂枝甘草汤加减治疗心血管疾病疗效观察［J］.福建医药杂志，2006，27（2）：149-150.

［4］黄海.试论经方的双向调节作用［J］.江西中医学院学报，2000，12（1）：26-27.

［5］黄海.桂枝甘草汤加减治疗心血管病［J］.中医杂志，2005，46（1）：71.

［6］郭翠萍.浅谈桂枝汤类方的双向调节作用［J］.中国医药卫生，2005，6（17）：121-122.

［7］周元国，王正国，朱佩.G蛋白在心脏功能调节中的作用蛋白在心血管功能调节及急性肺损伤中的作用研究［J］.第三军医大学报，1997（2）：159-162.

［8］齐普斯（美），贾莱夫（美）.郭继鸿，李学斌，译.心脏电生理：从细胞到临床［M］.北京：北京大学医学出版社，2008.