百色市献血者中人类疱疹病毒8型病毒DNA的PCR检测①

赵丽娟,陈源红,周正东,李晓华,黄干荣,覃艳春,曾怡②

(1.右江民族医学院微生物学与免疫学教研室,广西 百色 533000 E-mail:zhaolijuanxk@163.com;2.广西百色市中心血站,广西 百色 533000)

人类疱疹病毒8型(human hepersvirus 8,HHV-8),又称为卡波济肉瘤相关疱疹病毒(Kaposi's sarcoma-associated hepersvirus,KSHV)。根据其 137kb的双链 DNA特异性编码序列,类属于γ-2型人类疱疹病毒,于1994年由美国哥伦比亚大学病理学家张远首次发现。该病毒感染与卡波济肉瘤(Kaposi's sarcoma,KS),原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma,PEL),多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM),以及某些多中心卡斯特曼病(multicentric Castleman's disease,MCD)等多种肿瘤的发生有关,尤与各种KS的发生密切相关[1]。本研究应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)方法检测了百色市献血人群中的HHV-8感染状况,探讨本市HHV-8感染率及由此发生艾滋病相关的卡波济肉瘤的可能风险。

1 材料与方法

1.1 标本来源 2009年3月～2010年12月百色市部分无偿献血者肘静脉抗凝血679份,其中男性 356份,女性323份,均置-80°C冰箱保存。

1.2 试剂与仪器 PCR引物(由上海捷倍思生物工程公司合成)序列:Primer15′-TGG CGC TCC TAA TCC TAT G-3′,Primer25′-CAT CGG TCA GTT CTG TGG TG-3′;100bp ladder plus DNA标准分子量 Marker、PCR所用试剂 Taq DNA多聚酶及缓冲液、dNTP购自Fermentas公司;1-15PK冷冻离心机(德国Sigma),Mycycler PCR仪(美国Bio-Rad),Chemidoc XRS型凝胶成像系统(美国Bio-Rad)。

1.3 方法 取1ml冻存的抗凝血样,室温水浴解冻,转移至离心管,加入等体积磷酸盐缓冲液(PBS),室温 3500g离心15min,吸去上清。将沉淀重悬于 750μ l裂解缓冲液(10mmol/L Tris-Cl pH8.0,0.1mol/L EDTA pH8.0,0.5%SDS,20μ g/mg无DNase的胰 RNase),37℃温育1h;加蛋白酶K(20mg/ml)至终浓度100μ g/ml,50℃水浴 3h;用0.1mol/L Tris-Cl(pH8.0)平衡苯酚抽提3次;加入0.2倍体积的10mol/L醋酸钠及2倍体积无水乙醇沉淀 DNA,5000g离心5min,去上清;用70%乙醇洗涤 DNA沉淀,5000g离心 5min,重复 1次,彻底去除残余乙醇;加入500μ l TE(pH8.0)溶解DNA。取5μ l DNA溶液做模板,PCR检测血液标本中的HHV-8 DNA,PCR反应体系包括:引物 Primer110pmol;引物 Primer210pmol;10× Taq DNA聚合酶缓冲液 5μ l;MgCl 2.5mmol/L;dNTPs每种 2.5mmol/L;Taq DNA聚合酶 2单位;总反应体积 50μ l。扩增条件:预变性94℃5min;按94℃30s,59℃30s,72℃1min进行30个循环;最后72℃延伸5min。取PCR反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳后,在紫外灯下观察。

1.4 统计分析 组间阳性率的比较采用χ2检验。

2 结果

2.1 血液标本中HHV-8 DNA PCR检测 冻存的血液样本提取的DNA经PCR检测并用1.2%琼脂糖凝胶电泳后,在约370bp处出现条带者为阳性。部分电泳结果见图1。679份标本中检出阳性为9份,阳性率为1.33%。

图1 PCR检测血液标本中HHV-8 DNA

2.2 不同性别献血者中HHV-8 DNA阳性率的比较 356名男性献血者中检出 HHV-8 DNA阳性者 5名,阳性率为1.40%;323名女性献血者中检出4名,阳性率为1.24%。两组间阳性率采用χ2检验,P＞0.05。结果显示不同性别献血者中HHV-8 DNA阳性检出率差异无显著性,见表 1。

表1 血液标本中HHV-8 DNA PCR检测结果

3 讨论

在美国,有超过20%的AIDS患者同时患有KS,大约有12%的AIDS-KS患者死于KS相关的并发症[2]。目前我国人群中KS的发生较少,自20世纪80年代起新疆地区仅有少量病例报告。但不容忽视的是,我国人群的HIV感染数量已超过85万,而且正处于快速增长期。百色地区自1996年7月发现第一名HIV感染者,至今我地区已经出现艾滋病全地区性流行的严重趋势。根据已有的AIDS-KS发生发展规律,开展HHV-8血清流行病学调查有利于评估百色市HIV感染者罹患KS的风险。在不同国家或地区,除各种类型KS外,在HIV-1感染和未感染的人群中都曾检出KSHV的DNA或抗体,提示KSHV分布较广泛。国内外研究报道[1,3～6],HHV-8在英国健康鲜血者中的检出率为1.72%,美国的检出率为5.12%,意大利检出率为9%～22%,亚洲地区的日本为0.14%～0.20%,沙特阿拉伯为7%,我国台湾地区与美国近似。我国新疆献血人群血清中的HHV-8抗体检出率为12.5%～48%,但东北献血人群中的检出率为7.3%,浙江省检出率为16.1%。

笔者采用PCR检测法,检测献血者中HHV-8病毒DNA,679份标本中检出阳性为9份,阳性率为1.33%;其中男性5/356,阳性率1.40%;女性4/323,阳性率1.24%。结果表明在百色市献血人群中存在HHV-8感染,但与新疆、东北、浙江等省和地区的报道存在差异。笔者认为存在差异的原因在于:一是HHV-8流行情况复杂,在不同地区的流行情况均不一致。二是调查不同地区的HHV-8流行使用了不同的检测方法。新疆、东北、浙江等省和地区采用的是ELISA法检测献血者中的HHV-8抗体,本组通过采用 PCR法检测 HHV-8 DNA来调查HHV-8的感染率,检测法不同获得的结果不宜比较。本组的调查结果也显示,采用PCR法检测百色市献血者中的HHV-8 DNA,在不同性别的献血者中其检出率在统计学上差异无显著性。需要指出的是,本组所采用的PCR法为单次PCR,检出率相对巢式PCR(nest PCR,n-PCR)低。有必要采用ELISA和n-PCR法,进一步开展百色市献血者血液中HHV-8抗体和HHV-8 DNA调查,以评估献血人群中筛查HHV-8感染的必要性。

[1]Sarid R,Olsen SJ,Moore PS,et al.Kaposi's sarcoma associated herpesvirus:epidemiology,virology,and molecular biology[J].Adv Virus Res,1999,52:139-232.

[2]Moore PS,Gao SJ,Dominguez G,et al.Primary characterization of a herpesvirus agent associated with Kaposi's sarcomae[J].J Virol,1996,70(1):549-558.

[3]王炜琴,童杰峰,赵小英,等.浙江省献血者卡波氏肉瘤相关疱疹病毒感染的血清学研究[J].中国输血杂志,2001,4(1):46-47.

[4]杜文慧,陈国敏,孙荷,等.新疆地区普通人群中疱疹病毒8型IgG抗体的调查报告[J].中华实验和临床病毒学杂志,2000,14(1):44-46.

[5]王官清,徐宏慧,赵云络,等.中国东北地区健康献血者中人类疱疹病毒8的检测[J].中国皮肤性病学杂志,2002,16(2):83-86.

[6]齐眉,赵蔚明,周亚滨,等.济南地区献血者中人疱疹病毒8型(HHV-8)IgG抗体的检测及相关危险因素分析[J].山东大学学报:医学版,2006,44(4):328-331.