地瓜藤提取物对酪氨酸酶的激活作用

熊丽丹，李利

（1.四川省化妆品工程技术研究中心，四川 成都 610041；2.四川华肤生物科技有限责任公司，四川 成都 610041；3.四川大学华西医院皮肤科，四川 成都 610041）

地瓜藤为桑科榕属多年生落叶匍匐灌木植物地瓜榕FicustikouaBur.的茎、叶，性味苦、寒，归肺、肝、脾经。主要功能为清热利湿，通络，消肿，用于慢性支气管炎、痢疾、小儿消化不良、风湿疼痛、无名肿毒、脓疱疮、疥癣[1-2]。地瓜藤广范分布于我国的四川、广西、贵州、湖南等地，多野生，在川、桂、黔等地作为民间习用药材，常用鲜品捣敷外用，治无名肿毒、汤火伤。目前关于地瓜藤的研究极少，仅关永霞等[3]对其化学成分进行了研究，已知地瓜藤的提取物中含有呋喃香豆素类物质，而祖国传统医学用含呋喃香豆素类药物治疗白癜风的历史悠久，长期的临床实践证明含呋喃香豆素类药物对白癜风的治疗效果明显[4]。但尚未见地瓜藤治疗白癜风的报道。

白癜风是一种临床较常见的色素脱失性皮肤病，发病率为 0.5% ～2%[5]。研究发现，酪氨酸酶（Tyrosinase，TYR）活性降低是白癜风患者皮肤黑素合成受阻的重要因素。TYR是皮肤黑素生物合成的主要限速酶，其活性与黑素合成量呈正相关，调节TYR的活力即可控制黑素生成量，影响着白癜风的治疗效果。本实验采用蘑菇酪氨酸酶多巴速率氧化法，对地瓜藤激活TYR的作用进行研究，为采用地瓜藤治疗白癜风提供实验依据。

1 仪器与试药

KQ-300VDE型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；DNP-9025型电热恒温培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

地瓜藤植物样品采集于四川省简阳市郊区，经四川大学张浩教授鉴定为地瓜藤FicustikouaBur.，药用部位为茎、叶；补骨脂购自四川新荷花中药饮片有限公司，经四川大学张浩教授鉴定为补骨脂PsoraleacorylifoliaL.，药用部位为果实；酪氨酸酶（货号 T3824）和 L-多巴（货号 D9628）购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法

2.1 中药乙醇提取物的制备

地瓜藤鲜品、补骨脂干燥果实各200 g，分别用70%的乙醇室温下密闭浸泡2周，并不时振荡。滤过除渣收集乙醇提取液置60℃水浴中浓缩至浸膏状。用40 mL二甲基亚砜溶解后置4℃冰箱冻存备用。临用时用1／15 mol·L-1、pH 6.8磷酸缓冲液稀释至设定浓度。

2.2 酪氨酸酶活性测定[6]

将中药提取物用1／15 mol·L-1、pH 6.8磷酸缓冲液稀释后与蘑菇酪氨酶1 mL（100 U）混合，25℃孵育10 min。加入0.15%L-多巴反应液1 mL，继续孵育2 min，立即于分光光度计475 nm处测光吸收值A475。提取物的浓度设定为6，4，2，1，0.2 mg·mL-1。取5个浓度的补骨脂提取液为药物参比对照，每一实验重复3次。最后计算酪氨酸酶的激活率，酪氨酸酶激活率（%）＝[（C-D）-（A-B）]／（AB）×100，其中 A：PBS+L-DOPA+TYR；B：PBS+L-DOPA；C：中药 +L-DOPA+TYR；D：中药+L-DOPA+PBS。

2.3 不同溶剂对乙醇提取物萃取及各萃取物对酪氨酸酶激活率的测定

地瓜藤鲜品200 g，用70%的乙醇室温下密闭浸泡2周，并不时振荡。滤过除渣收集乙醇提取液置60℃水浴中浓缩至无醇味。将地瓜藤乙醇提取浓缩液依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇进行萃取，每种萃取剂萃取3次，常压蒸馏浓缩，挥干溶剂。取各萃取物1g，用二甲基亚砜溶解后，再用1／15 mol·L-1、pH 6.8磷酸缓冲液定容于 1 L容量瓶中，配成1 mg·mL-1的溶液，按2.2所述方法测定其对酪氨酸酶的激活率。

2.4 地瓜藤影响酪氨酸酶活性的动力学研究

在一定量的1／15 mol·L-1、pH 6.8的磷酸缓冲液中，加入不同剂量的L-DOPA为底物和0.2 mL的地瓜藤萃取物后，于25℃孵育10 min，快速加入50μL酪氨酸酶溶液，即刻记时，观察分光光度计475 nm处1 min时的吸光度（A475），最终反应体系为3.0 mL，以双蒸水作为实验空白对照，根据产物的消光系数测得酶活力。采用Lineweaver-Burk双倒数法制得酶动力学曲线，通过所得直线求出激活剂作用下的表观米氏常数（Kmapp）和表观最大反应速度（Vmapp），与不加地瓜藤萃取物（以双蒸水作为空白对照）时原始的Km和Vmax进行比较，以判定激活剂作用于底物和酪氨酸酶的方式。

2.5 统计学处理方法

所测实验数据用SPSS 17.0统计处理，以均数±标准差（±s）表示，采用单因素ANOVA方差分析LSD进行统计学分析。

3 结果

3.1 地瓜藤乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响

5个浓度的地瓜藤提取物对酪氨酸酶的激活率都为正值，表明5个浓度的地瓜藤提取物对酪氨酸酶均有不同程度的激活作用。与0.2 mg·mL-1补骨脂提取物对照组比较，浓度为1 mg·mL-1的地瓜藤提取物对酪氨酸酶的激活调控作用最为显著，达64.58%；浓度在2 mg·mL-1时，具较明显的酪氨酸酶激活作用，为49.43%；浓度为0.2，4，6 mg·mL-1对酪氨酸酶调控无明显激活作用，但均未产生抑制作用。而作为治疗白癜风的常用中药补骨脂在低浓度对酪氨酸酶具激活作用，在高浓度对酪氨酸酶具抑制作用。补骨脂提取物随浓度的增加，对酪氨酸酶激活作用逐渐降低，当浓度达4 mg·mL-1时表现出抑制作用。结果见表1。

表1 乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响（±s，n＝3）

表1 乙醇提取物对酪氨酸酶活性的影响（±s，n＝3）

注：与对照药物0.2 mg·mL-1浓度组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

／%地瓜藤乙醇提取物名称 浓度／mg·mL-1 激活率64.58±0.627**249.43±0.349*420.41±1.1166 9.25±1.162*补骨脂乙醇提取物 0.237.14±0.2321 29.02±0.1392 9.95±0.2564-5.45±0.4190.234.28±0.3721-13.69±0.2096

3.2 各萃取物对酪氨酸酶的激活作用

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇3种溶剂对地瓜藤乙醇提取物萃取，所得各萃取物对酪氨酸酶的激活作用，在浓度为1 mg·mL-1时激活率均为正值，表明4种萃取物对酪氨酸酶均有不同程度的激活作用。乙酸乙酯萃取物对酪氨酸酶的激活调控作用最为显著，为84.30%；石油醚萃取物、正丁醇萃取物对酪氨酸的激活率分别为68.88%、38.24%。结果见图1。

图1 地瓜藤萃取物对酪氨酸酶激活率的影响（±s，n＝3）

3.3 地瓜藤影响酪氨酸酶活性的动力学分析

与不加地瓜藤萃取物时原始的Km和Vmax相比，地瓜藤石油醚萃取物的Km值基本不变，Vmax增大，为非竞争性激活作用，表明石油醚萃取物所含活性成分在酶促反应体系中，激活酪氨酸酶的方式是提高酶促反应的速率完成的；地瓜藤乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的Km降低，Vmax增大，为混合型激活作用，表明乙酸乙酯和正丁醇萃取物在酶促反应体系中，通过影响底物与酶的结合，改变酶的空间构型，从而提高酶与底物的亲和力，并能提高反应速度。结果见图2、表2。

图2 地瓜藤萃取物对酪氨酸酶的激活类型（±s，n＝3）

表2 地瓜藤萃取物对酪氨酸酶活性作用的动力学分析（±s，n＝3）

表2 地瓜藤萃取物对酪氨酸酶活性作用的动力学分析（±s，n＝3）

萃取物 常数测定Km V激活类型max 0.77±0.0447.77±0.48石油醚萃取物 0.78±0.0375.19±0.97 非竞争性乙酸乙酯萃取物 0.69±0.05135.25±4.92 混合型正丁醇萃取物 0.58±0.0261.24±1.49对照混合型

4 讨论

人体肤色深浅主要取决于表皮中黑素细胞（Melanocyte，MC）合成的黑素量、大小及种类[7]。正常情况下，MC通过其树状突将胞内合成的黑素输送到基底细胞与角质形成细胞中，形成皮肤颜色并发挥保护细胞免受紫外线损伤的作用。白癜风是临床较常见的色素脱失性皮肤病，与表皮中MC代谢异常密切相关，酪氨酸酶活性降低是白癜风患者皮肤黑素合成受阻的重要因素。中药治疗白癜风等色素减退性皮肤病已经成为目前研究的热点，药物可以通过提高皮肤内酪氨酸酶的活性，增加黑素的合成，从而治疗白癜风。本实验着重探讨了地瓜藤对酪氨酸酶的激活作用，并对其进行系统的提取、分离和分析，以期得到对酪氨酸酶有较好激活效果的有效成分，为今后治疗白癜风等色素减退性皮肤病提供基础。

本实验研究表明，地瓜藤的乙醇提取物对酪氨酸酶确有相当明显的激活作用，激活率最高可达64.58%，而且并非随浓度的变化呈线性变化，浓度超过一定的程度时，对酪氨酸酶的激活作用逐渐降低，其中的机理目前尚不清楚。在各萃取物对酪氨酸酶激活作用研究中发现，乙酸乙酯萃取物、石油醚萃取物对酪氨酸的激活率分别为84.30%、68.88%，比在相同浓度下地瓜藤乙醇提取物对酪氨酸酶的激活率分别提高了19.72%、4.30%。因此，选用乙醇为提取剂，再用乙酸乙酯萃取，能够在地瓜藤中提取到较多活化酪氨酸酶的活性成分。在本实验中还发现，地瓜藤萃取物中含有的活性物对酪氨酸酶具非竞争性激活和混合型激活多重激活作用，由此推测地瓜藤含有的活性物质既能提高酶促反应的速率，又能与酶分子上的基团结合，改善酶的空间构型，提高酶的亲和力，从而使酶的基团更好地与底物络合。

地瓜藤资源丰富，为民间习用药材，其促进酪氨酸酶活性的药理作用尚未见文献报道。本研究为临床治疗白癜风提供了思路，但其所具有的临床应用价值将有待于进一步研究。