参连汤及其有效组分配伍对α-葡萄糖苷酶的影响△

唐姗，胡嵘，孙佳明，张辉

（长春中医药大学，吉林 长春 130117）

糖尿病是一种内分泌代谢紊乱性疾病，临床以高血糖、葡萄糖耐量减低及胰岛素释放异常为主要标志。随着2型糖尿病的药物治疗已经取得了一定进展，α-葡萄糖苷酶抑制剂以其见效快且毒副作用小成为治疗2型糖尿病的一类新型药物[1]。α-葡萄糖苷酶位于小肠刷状缘膜上皮细胞，它能将双糖，如蔗糖、麦芽糖等水解成可被小肠吸收的单糖，是食物中碳水化合物水解的关键酶。因此，抑制该酶活性能够延缓碳水化合物在肠道的吸收，减少葡萄糖吸收入血，达到防治餐后高血糖症和缓解高胰岛素血症的目的[2-3]。

参连汤出自 《万病回春》，由人参、黄连组成，有补气养阴，清热燥湿之功。现代药理研究证实，人参黄连药对能够调节空腹血糖、血胰岛素，改善胰岛素抵抗，被广泛地应用于糖尿病的临床治疗[4]。

本实验通过比较不同溶剂制备的参连汤样品及其有效组分黄连总生物碱、人参总皂苷的不同比例配伍样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，对古方及有效组分配伍的降糖作用进行评价，为合理开发古方参连汤提供科学依据。

1 材料

1.1 药品

人参、黄连药材购于长春宏检大药房，均经长春中医药大学张辉教授鉴定为正品；黄连总生物碱（实验室自制，已申请发明专利，申请号201110243033.5），经紫外分光光度法，在波长349 nm检测总碱纯度＞99%；人参总皂苷（宏久参业科技股份有限公司，纯度＞75%）。

1.2 试剂与仪器

α-葡萄糖苷酶（美国Sigma公司）；葡萄糖测定试剂盒（上海荣盛生物技术有限公司）；其余试剂均为分析纯。酶标仪（Bio-Rad）；旋转式恒温振荡器（苏州培英实验设备有限公司）；96微孔板，各型号移液枪及枪头等。

2 方法

2.1 有效组分黄连总生物碱、人参总皂苷配伍组合

如表1所示。

表1 黄连总生物碱、人参总皂苷配伍比例

2.2 参连汤样品的制备

2.2.1 水煎煮样品 取人参药材粗粉10 g，黄连药材粗粉20 g，加14倍量水煎煮3次，每次3.5 h，滤过，合并滤液，减压干燥得干膏，粉碎备用。

2.2.2 乙醇回流样品 取人参药材粗粉10 g，黄连药材粗粉20 g，加20倍量85℃70%乙醇回流提取4次，每次2 h，滤过，合并滤液，减压干燥得干膏，粉碎备用。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

根据已有方法[5]改进，实验共设阴性、空白、样品3个组，每组平行3个孔，按表2加入各溶液，37℃温育15 min，各孔加入180μL葡萄糖测定试剂，37℃温育15 min，于490 nm波长下测定OD值。采用葡萄糖氧化酶法，以葡萄糖的生成量计算α-葡萄糖苷酶抑制活性，酶活性抑制率（%）＝（阴性-样品）／（阴性-空白）×100%。样品设定1，2，3，4，5 mg·mL-15个浓度，以抑制率为纵坐标，样品浓度为横坐标绘制得到抑制率曲线，并计算相应IC50值。

表2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定加入溶液／μL

2.4 葡萄糖氧化酶抑制活性测定

按2.3项下方法测定配伍2组受试药物对葡萄糖氧化酶抑制活性，实验共设阴性、空白、样品3个组，每组平行3个孔，按表3加入各溶液，37℃温育15 min，各孔加入180μL葡萄糖测定试剂，37℃温育15 min，于490 nm波长下测定OD值。以葡萄糖的生成量计算葡萄糖氧化酶抑制活性，酶活性抑制率（%）＝（阴性-样品）／（阴性-空白）×100%。样品设定1，2，3，4，5 mg·mL-15个浓度，计算抑制率。

表3 葡萄糖氧化酶抑制活性测定加入溶液／μL

3 结果

3.1 不同样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性

按2.3项下对各组样品进行α-葡萄糖苷酶抑制活性测定，实验数据进行t检验，结果用±s表示，如表4所示。

表4 不同样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n＝3）

表4 不同样品的α-葡萄糖苷酶抑制活性（±s，n＝3）

注：*P＜0.01

组别 IC50／mg·mL-1配伍1组2.0952±0.1204配伍2组 1.2209±0.0828*配伍3组 2.3801±0.1487配伍4组 3.5346±0.1710配伍5组 3.5692±0.0894参连汤水煎煮组 2.7426±0.1324参连汤乙醇回流组2.1621±0.1718

在实验测定范围内，参连汤与有效组分各配伍组对α-葡萄糖苷酶均有一定的抑制作用，尤其是黄连总生物碱与人参总皂苷配伍2组（8∶2）最佳，大于乙醇回流提取组和水煎煮提取组。

3.2 不同样品的葡萄糖氧化酶抑制活性

按2.4项下对配伍2组样品进行葡萄糖氧化酶抑制活性测定，结果用±s表示，如表5所示。

表5 不同样品的葡萄糖氧化酶抑制活性（±s，n＝3）

表5 不同样品的葡萄糖氧化酶抑制活性（±s，n＝3）

注：表中-为负值，无意义

浓度／mg·mL-1 12 34 5抑制率／% （1.89±0.1264）（0.24±0.1703）---

从表5可知，配伍2组受试药物对葡萄糖氧化酶几乎没有抑制作用，2.3项下建立的筛选模型可以避免药物对葡萄糖氧化酶活性的影响，避免假阳性的出现。另外，2.3项下为7组样品平行试验，即使存在对葡萄糖氧化酶抑制作用，也属于系列误差，对组间比较无明显影响。

4 讨论

本试验选择了以直接水解物蔗糖为底物的筛选模型，具有以下优点：（1）经济、快捷，筛选仅需微量样品，灵敏度高，可进行体外高通量筛选；（2）筛选得到的 α-GI（α-葡萄糖苷酶抑制剂）靶向作用具体，作用机制确切。（3）与PNPG底物筛选模型相比，假阳性率较低，具有定向筛选的特点[1]。因此，选择以蔗糖为底物的酶-抑制剂-96微孔板筛选模型是一种行之有效的α-GI筛选方法。

对不同提取方法制备的参连汤及其有效组分配伍组合的α-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，发现各组均具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制活性。从数据直观分析，不同提取方法的参连汤样品比较，乙醇回流提取的抑制活性高于水煎煮提取，说明古方的传统提取工艺有一定的限制性，未能将参连汤中α-GI充分煎出，而采用乙醇回流法提取，能够提高α-GI的提取效率。

单用黄连总生物碱对α-葡萄糖苷酶的抑制作用强于单用人参总皂苷，当二者配伍时，随着黄连总生物碱比例的逐渐增大，抑制活性逐渐增强。尤其是配伍2组（黄连总生物碱与人参总皂苷8∶2）的IC50值最小，说明黄连总生物碱在配伍样品中可能起主导作用，而人参总皂苷为协同促进作用。

在实验范围内的有效组分最优配伍是黄连总生物碱与人参总皂苷8∶2，即4∶1。根据黄连中总生物碱含量约为8%[6]，人参中总皂苷含量约为4%[7]，折合成原药材量比例为黄连-人参（2∶1），正与参连汤古方组成相吻合。而有效组分配伍时的抑制活性远高于传统古方药材的提取样品，说明黄连总生物碱、人参总皂苷是参连汤中抑制α-葡萄糖苷酶的主要活性部位。经过现代工艺，将黄连、人参的有效组分进行提取和配伍，形成复方组分中药，既具有现代药学的先进性，又有中医药复方联合用药的传统特点[8]。由于是由纯度更高的有效组分提取物所组成，因而不仅能够提高药效，更重要的是便于进行药效作用机制、药物代谢等深入的研究，进而明确每个组分对参连汤功能主治所贡献的药效学作用及其作用机制，也可以进一步阐明各个组分之间的相互作用的性质[9]，进一步为参连汤治疗糖尿病做出贡献。